Synchrotronová rentgenová absorpční spektroskopie melanosomů u obratlovců a hlavonožců: Důsledky pro afinitu Tullimonstrum

Úvod

Screeningové pigmenty jsou nezbytnou součástí zrakových systémů živočichů, protože pohlcují bludné světlo, a umožňují tak směrovou fotorecepci a ochranu fotoreceptorů před ultrafialovým zářením . Mezi screeningové pigmenty bezobratlých patří ommochromy, pteriny a méně často melanin . Naproti tomu hlavním screeningovým pigmentem u obratlovců je melanin, který se vyskytuje ve formě melanosomů (membránových organel) v duhovce, cévnatce, pigmentovém epitelu sítnice (RPE) a skléře (obrázek 1). Melanosomy RPE zahrnují kulovité a podlouhlé formy, které jsou prostorově rozděleny . V jasném dopadajícím světle migrují podlouhlé melanosomy k apikálním výběžkům buněk RPE, čímž chrání světlocitlivé pigmenty ve fotoreceptorových buňkách před vybělením. Zajímavé je, že oči záhadného taxonu Tullimonstrum gregarium (karbon, Mazon Creek, IL, USA) rovněž vykazují po sobě jdoucí vrstvy melanosomů různé geometrie. Tento rys byl interpretován jako důkaz příbuznosti s obratlovci na základě přehledu rozložení a morfologie melanosomů u žijících živočichů . Zda jsou oční melanosomy bezobratlých uspořádány do po sobě jdoucích tkáňových vrstev jako u obratlovců, však není známo. Vyřešení této otázky vyžaduje systematické zkoumání screeningových pigmentů v očích bezobratlých. Hlavonožci jsou ideálním testovacím případem, protože stejně jako obratlovci mají složité oko ve stylu kamery s několika vrstvami pigmentovaných tkání a je o nich známo, že produkují melanosomy (v inkoustovém váčku ). Systematicky jsme charakterizovali anatomické umístění a chemické složení pigmentových tkání a geometrii pigmentových granulí v očích chobotnice obecné (Octopus vulgaris), chobotnice obecné (Loligo vulgaris), sépie obecné (Sepia officianalis), mihule mořské (Petromyzon marinus) a okouna evropského (Dicentrachus labrax) v kombinaci s údaji z fosilií (elektronický doplňkový materiál, tabulka S1). Tkáně byly analyzovány pomocí Warthin-Starryho histologického barvení, alkalické oxidace peroxidem vodíku (AHPO ) a skenovací elektronové mikroskopie (SEM). V očích žijících obratlovců snižuje melanin oxidační stres tím, že chelatuje ionty kovů, a nedávné práce ukazují, že melanosomy obratlovců mají tkáňově specifickou chemii stopových prvků . Proto jsme testovali, zda chemismus stopových prvků dokáže rozlišit melanosomy očí obratlovců a hlavonožců pomocí synchrotronové rychlé skenovací rentgenové fluorescence (SRS-XRF) a rentgenové absorpční spektroskopie blízké hranové struktuře (XANES).

Obrázek 1. Jaký je chemismus stopových prvků? Anatomie očí žijících hlavonožců a obratlovců. Schematické znázornění (a) oka hlavonožců a (b) oka obratlovců s vloženými detaily vrstev tkání. (c) Histologické řezy a skenovací elektronové mikrofotografie (SEM) očí Loligo, Octopus, Sepia a Petromyzon. Řezy jsou obarveny Warthin-Starrym; melanin se jeví jako černý. Všechny tkáně vykazují mikrotkáně podobné melanosomům. C, cévnatka; I/černé šipky, duhovka; L, čočka; O, zrakový nerv; OG, ganglia zrakového nervu; R, sítnice; RPE/*, pigmentový epitel sítnice; RPL/šipky, pigmentová vrstva sítnice; S/bílá šipka, skléra; SCL, subciliární vrstva; V, sklivec. (Online verze v barvě.)

Materiál a metody

(a) Moderní a fosilní exempláře

Od komerčních dodavatelů (Ballycotton Seafoods a K O’Connell Fish Merchants (English Market v Corku, Irská republika) a Online Baits UK) byly získány exempláře chobotnic, sepií, lilií, petromyzonů a dicentrachů (každý n = 5). Mihule byly dodány zmrazené a pitvány ihned po rozmrazení; hlavonožci a okouni byli v době nákupu mrtví a byli pitváni do 24 hodin po smrti. Oči byly fixovány v 2,5% glutaraldehydu po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, dehydrovány v ethanolu a před další analýzou uloženy v 70% ethanolu.

Tato studie zahrnuje analýzu očních důlků následujících osmi fosilií: z Mazon Creek, dvou exemplářů Tullimonstrum (CKGM F 6426 a FMNH PE 22061), po jednom exempláři obratlovců Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) a Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) a jediného exempláře fosilního hlavonožce Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); z Green River (eocén, Colorado/Utah/Wyoming), jeden exemplář Knightia sp. (FOBU 17591) a z Furské formace (eocén, Dánsko) neurčený exemplář Teterodontiformes (NHMD 199838); z Hâkel and Hâdjoula Lagerstätte (pozdní křída, Libanon) fosilní chobotnice Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Institucionální zkratky: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Natural History Museum of Denmark; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Alkalická hydroxidová peroxidace a hydrolýza kyselinou hydrojodovou

Tkáně byly vypreparovány pomocí sterilních nástrojů, uloženy do skleněných lahviček, vysušeny mrazem a rozemlety na prášek. Cévnatku obratlovců a RPE nebylo možné oddělit, a proto byly v této analýze považovány za jednu tkáň. Lyofilizované vzorky tkáně (9-17 mg) byly homogenizovány ve vodě pomocí Ten-Broeckova homogenizátoru na koncentraci 10 mg ml-1 a 100 µl nebo 200 µl alikvoty zpracovány pomocí AHPO a hydrolýzy kyselinou jodovou . AHPO po hydrolýze HCl testuje přítomnost kyseliny pyrrol-2,3,5-trikarboxylové (marker pro eumelanin); analýza kyselinou jodovou testuje přítomnost 4-amino-3-hydroxylfenylalaninu (marker pro feomelanin).

(c) Histologie

Rozřezané vzorky tkání z očí hlavonožců a cévnatky, duhovky, RPE a skléry z očí obratlovců byly fixovány pomocí 2,5% glutaraldehydu po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Fixované vzorky tkání byly zpracovány pro histologické vyšetření a obarveny pomocí Warthinova-Starryho protokolu, který testuje přítomnost melaninu.

(d) Skenovací elektronová mikroskopie

Malé vzorky (přibližně 1-2 mm2) očních tkání byly vysušeny pomocí hexamethyldisilazanu nebo tekutého dusíku. Vysušené vzorky tkáně a odkryté tenké řezy byly upevněny na hliníkové stonky, potaženy naprašováním zlatem/paládiem a zobrazeny při urychlovacím napětí 5-15 keV pomocí FEI Quanta 650 SEM a Zeiss Gemini Supra 40 SEM. Analýzy energiově disperzní rentgenovou spektroskopií (EDS) byly provedeny pomocí přístroje Hitachi S-3500N VP-SEM vybaveného energiově disperzním spektrometrem EDAX Genesis při urychlovacím napětí 15 kV s akvizičními časy 120 s pro mapy EDS (elektronický doplňkový materiál, obrázek S1).

(e) Analýza geometrie a velikosti melanosomů

Údaje o geometrii byly měřeny pro nejméně 20 melanosomů (a případně melanosomům podobných mikrotvarů) pro každou tkáň v každém vzorku. Rozdíly v geometrii byly testovány pomocí ANOVA nebo (pokud jsou údaje heteroskedastické) Welchova F-testu spojeného s párovou post hoc analýzou v programu PAST (Tukey pro analýzu ANOVA, resp. Dunn pro analýzu Welchova F-testu) . Údaje o geometrii melanosomů pro S. officianalis jsou homoskedastické, ale nenormální, a proto byly analyzovány po logaritmické transformaci.

(f) Synchrotronová rychlá skenovací rentgenová fluorescence

Měření byla provedena na svazcích 2-3 a 10-2 na Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). Energie dopadajícího rentgenového záření byla nastavena na 11 keV s použitím monochromátoru s dvojitým krystalem Si (111) se zásobním kroužkem obsahujícím 500 mA v režimu top-off při 3,0 GeV. Na svazkové lince 2-3 byl mikrofokusovaný svazek o rozměrech 2 × 2 µm zajištěn párem zrcadel Kirkpatrick-Baez s Rh povlakem, zatímco na svazkové lince 10-2 byly použity wolframové apertury pro dosažení volitelných velikostí svazku mezi 25 a 200 µm. Intenzita dopadajícího rentgenového záření na každé svazkové linii byla měřena pomocí dusíkem plněné iontové komory. Vzorky byly umístěny pod úhlem 45° k dopadajícímu rentgenovému svazku a byly prostorově rastrovány po dobu 20-50 ms pixel-1 . Na beamline 2-3 byly mapovány: odkryté a nebarvené tenké řezy očí z jednoho jedince Dicentrachus a Octopus a ze dvou jedinců Loligo a Petromyzon; oční skvrny jednoho exempláře Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. a Teterodontiformes indet. Na beamline 10-2 byly mapovány: druhý exemplář Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia a vzorky měkkých tkání z Keuppia sp. Dvě různé beamline byly využity k umístění vzorků/vzorků různých velikostí (exempláře příliš velké pro vzorkovací stupeň na beamline 2-3 byly umístěny na 10-2). Údaje o fosiliích z každé beamline byly kalibrovány podle stejné sady standardů, a proto jsou odchylky v údajích skutečné a neodrážejí odchylky v analytických parametrech. V každém datovém bodě bylo shromážděno celé fluorescenční spektrum a intenzita fluorescenčních čar pro vybrané prvky (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu a Zn) byla sledována pomocí křemíkového driftového detektoru Vortex (Hitachi, USA) spojeného se systémem zpracování pulzů Xpsress3 (Quantum Detectors) pro rozlišení energie. Intenzity fluorescence byly korigovány na mrtvou dobu detektoru a normalizovány vůči vstupnímu toku (I0STRM). Koncentrace jednotlivých prvků v µg cm-2 byly kalibrovány pomocí tenkovrstvých prvkových standardů sledovatelných NIST. Zpracování dat bylo provedeno pomocí softwaru MicroAnalysis Toolkit . Pro koncentrace jednotlivých prvků ve vybraných zájmových oblastech byly vypočteny průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Rozdíly v koncentracích prvků mezi zájmovými oblastmi byly vyhodnoceny pomocí lineární diskriminační analýzy (LDA) v programu PAST . Data byla seskupena pomocí jedné klasifikační úrovně odpovídající tkáni původu, např. retinální pigmentová vrstva (RPL) octomilky, duhovka Petromyzon, skléra Petromyzon, oční skvrna FMNH PE 22061 atd. Analýza hlavních komponent dat dává rozdělení dat, které je téměř identické s LDA (elektronický doplňkový materiál, obrázek S4a,b).

(g) Rentgenová absorpční spektroskopie blízké hranové struktury

Spektra XANES byla pořízena na beamline 2-3 v SSRL ze zájmových bodů identifikovaných v mapách XRF. Toho bylo dosaženo postupným vedením energie dopadajícího svazku přes hranu Cu K a zaznamenáváním intenzity emitované čáry Kα jako funkce dopadající energie . Kalibrace energie monochromátoru byla provedena pomocí Cu fólie. XANES spektra byla získána z RPL a skléry Loligo, cévnatky Petromyzon a z očních skvrn v exempláři Tetradontiformes indet., Knightia a Tullimonstrum (CKGM F 6426). Spektra byla zpracována pomocí softwarového balíku Athena .

Výsledky

(a) Melanin a melanosomy v očích žijících hlavonožců a obratlovců

Očekávaně několik odlišných vrstev tkáně v očích všech studovaných hlavonožců vykazuje černé, melaninově specifické barvení (obrázek 1). Tyto údaje jsou podpořeny analýzami AHPO, které potvrzují, že obarvené tkáně Loligo, Octopus a Sepia jsou bohaté na eumelanin a v menší míře na feomelanin (elektronický doplňkový materiál, tabulka S2). SEM analýza tkání bohatých na melanin potvrzuje přítomnost sféroidních/podlouhlých mikrotvarů (viz také ; obr. 1). Je velmi nepravděpodobné, že mikrobodie představují rozpadové bakterie, protože ty se vyskytují v neporušených očích čerstvě usmrcených exemplářů bez známek poškození tkáně, vykazují konzistentní velikostně specifické vrstvení mezi exempláři téhož taxonu a jsou stabilní pod elektronovým paprskem. Dále je nepravděpodobné, že by mikrobodie představovaly ommochromová zrnka, protože se vyskytují ve vrstvách tkáně, které se pozitivně barví na melanin v histologickém řezu a obsahují diagnostické markery pro eumelanin v analýzách AHPO. Nejsou přítomny žádné jiné mikrobodie, které by mohly vést k těmto výsledkům. Mikrobodie ve vrstvách tkáně barvících se černě v histologických řezech očí hlavonožců jsou tedy nejpravděpodobněji interpretovány jako melanosomy.

U žijících hlavonožců se melanosomy vyskytují v duhovce a v dalších vrstvách tkáně nacházejících se v zadní části oka (zde definované jako RPL) a za duhovkou (zde definované jako subciliární vrstva (SCL); obr. 1a,c). Všichni studovaní hlavonožci mají SCL, ale vzorky této tkáně v histologické kvalitě bylo možné získat pouze u octomilek. Melanosomy se významně liší v geometrii mezi duhovkou a RPL jak u Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3), tak u Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (obr. 2a,c). Rozdíly v geometrii očních melanosomů u Octopus a Petromyzon jsou statisticky významné u některých, ale ne u všech populací melanosomů (obr. 2b,d; elektronický doplňkový materiál, tabulka S4). Kromě melanosomů obsahuje sítnice hlavonožců hojně subangulárních granulí nepravidelného tvaru (obr. 1c). Tato geometrie neodpovídá geometrii známých melanosomů u obratlovců a hlavonožců; granule tedy mohou představovat ommatiny nebo jiné světlocitlivé pigmenty, ale jejich identita musí být ještě chemicky prokázána. Různé tkáně v oku mníka a okouna se barví na eu- a feomelanin (obr. 1b,c); analýza AHPO potvrzuje přítomnost melaninu v těchto tkáních a prokazuje výrazné rozdíly v koncentraci eumelaninu mezi očima obou obratlovců (elektronický doplňkový materiál, tabulka S2).

Obr. 2. Tkáně v oku mníka a okouna se barví na eu- a feomelanin (obr. 1b,c). Geometrie očních melanosomů. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia a (d) Petromyzon.

V souhrnu naše data ukazují, že melanosomy v různých tkáních oka mají u žijících hlavonožců i obratlovců výrazně odlišnou geometrii (elektronický doplňkový materiál, tabulky S3 a S4; obrázek 2).

(b) Chemie očních melanosomů

Pomocí SRS-XRF a XANES jsme testovali, zda lze chemií stopových kovů rozlišit oční melanosomy obratlovců od melanosomů hlavonožců. V očích žijících olihní a chobotnic vykazuje nápadné prostorové rozdělení pouze Cu (obr. 3a,b): je obohacena ve skléře, ale ne v RPL bohaté na melanin (ani v jiných tkáních). Zn vykazuje jemné rozdělení u obou analyzovaných taxonů hlavonožců: je mírně obohacen v RPL chobotnice a v menší míře ve skléře chobotnice. U obratlovců však tkáně nesoucí melanosom vykazují nápadné rozdělení Zn (a u mihule také Fe a Cu) (obr. 3c,d). U mihule je Fe obohaceno v duhovce; Zn je obohaceno v duhovce a zejména v cévnatce a RPE a Cu je obohaceno ve všech tkáních nesoucích melanosom. U okouna je Zn obohacen ve všech tkáních nesoucích melanosom. Na XRF mapách očí žijících obratlovců nelze cévnatku a RPE rozlišit pomocí chemie stopových prvků nebo ultrastruktury, což vyžaduje, aby byly považovány za jednu tkáň. Domníváme se, že to nemá vliv na naše hlavní výsledky, protože naše údaje z hlavonožců a dalších očních tkání obratlovců ukazují, že vnitrodruhová chemická variabilita je v porovnání s mezidruhovou variabilitou malá (obr. 4a,b). Tkáně bohaté na melanosomy v očích existujících obratlovců, ale nikoliv hlavonožců, jsou tedy obohaceny o Zn (a někdy i o Fe a Cu) ve srovnání s ostatními očními tkáněmi.

Obrázek 3: Tkáně bohaté na melanosomy v očích existujících obratlovců. SRS-XRF analýza histologických řezů Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) a Dicentrachus (d) a fosilních obratlovců (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) a Knightia (f), fosilních hlavonožců Keuppia (g) a Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Histologické řezy jsou barveny Warthin-Starrym; melanin se jeví jako černý. SRS-XRF mapy v (a-h) jsou z oblastí zobrazených na histologických řezech a fotografiích. Umístění oblastí na fotografiích histologických řezů a umístění oblastí na fotografiích zobrazených fosilií viz elektronický doplňkový materiál, obrázek S2. Černé šipky – duhovka; hroty šipek – RPL; hvězdička – RPE; bílé šipky – skléra. Maximální hodnoty koncentrací pro každou mapu SRS-XRF jsou uvedeny v elektronickém doplňkovém materiálu, tabulka S5. (Online verze v barevném provedení.)

Obrázek 4. Chemismus stopových prvků zachovaných a fosilních hlavonožců a obratlovců a Tullimonstrum. (a) LDA na základě naměřených koncentrací Ti, Fe, Cu a Zn. (b) Biplot klíčových prvků přispívajících k variabilitě v bodě (a). (c) XANES spektra vybraných vzorků a standardů na hraně Cu K (přerušovaná čára při 8987 eV). Větší variabilita chemismu mezi Tullimonstrum a ostatními fosiliemi z Mazon Creeku uvedená v bodě (a) ve srovnání s variabilitou mezi ostatními fosilními biotami je přítomna i po odstranění Fe ze souboru dat (elektronický doplňkový materiál, obrázek S4c,d). Šipky v (c) označují polohu předokrajových prvků v těchto spektrech. Data pro fosilní inkoustový váček olihně jsou z .

Pro ověření, zda tento signál přetrvává ve fosiliích, jsme analyzovali oční skvrny u dvou fosilních hlavonožců a čtyř fosilních obratlovců. S výjimkou hlavonožce Pohlsepia z Mazon Creek obsahují oční skvrny u všech exemplářů mikrobodie podobné melanosomům (elektronický doplňkový materiál, obrázek S3). SRS-XRF mapy ukazují, že oční skvrny u fosilních obratlovců Knightia a Tetradontiformes indet. (obr. 3e-f) jsou obohaceny o Ti a Cu vzhledem k sedimentární matrici, přičemž u posledně jmenovaných je obohacení Zn nepatrné. Naproti tomu očnice Keuppia je relativně obohacena pouze o Ti, Fe a Zn (obr. 3g). Očnice Tullimonstrum je obohacena o Ti, Fe, Cu a Zn vzhledem k okolním měkkým tkáním (obr. 3h). Tyto chemické údaje nejsou zcela v souladu se signálem u studovaných fosilních hlavonožců nebo fosilních obratlovců.

Pro zkoumání variability koncentrací klíčových prvků Ti, Fe, Cu a Zn v našem souboru dat jsme použili LDA. Oční tkáně u současných obratlovců a hlavonožců se vykreslují v oddělených oblastech chemoprostoru a odděleně od svých fosilních protějšků (obr. 4a,b). Kritické je, že chemismus stopových prvků očních skvrn u jednoznačných obratlovců z Mazon Creeku je odlišný od obou exemplářů Tullimonstrum, které vykreslují blízko sebe. Oddělení jednoznačných obratlovců z Mazon Creeku od Tullimonstrum podél osy LD2 odráží obohacení prvně jmenovaných obratlovců o Zn a v menší míře o Cu a Fe: zajímavé je, že to odráží rozdíly v chemismu mezi žijícími obratlovci a hlavonožci. Oční skvrny Tullimonstrum jsou však chemicky odlišné od skvrn Pohlsepia, jednoznačného hlavonožce z Mazonského potoka.

Zkoumali jsme variabilitu oxidačního stavu Cu, kovu běžně spojovaného s melaninem , u vybraných fosilních a moderních taxonů pomocí XANES. Spektra XANES na hraně Cu K odebraná z cévnatky mihule a ze dvou fosilních očních skvrn obratlovců vykazují všechny absorpční píky se středem při 8994 ± 1 eV, což naznačuje silný příspěvek Cu(II) (obr. 4c). Spektra z RPL olihně (melanizované) a skléry (nemelanizované) se do značné míry podobají spektrům obratlovců, ale vykazují předhroty při 8978,59 eV, resp. 8977,58 eV, jejichž poloha prozrazuje přítomnost Cu(I) . Ve spektru Keuppia se objevuje prvek preedge v rozmezí 8976,73-8984,27 eV, který rovněž odráží příspěvek Cu(I). Přítomnost Cu(I) ve spektrech XANES zachovalých a fosilních hlavonožců by mohla odrážet redukci Cu(II) během analýzy. Vzorky obratlovců však nevykazují žádný příspěvek Cu(I), přestože byly analyzovány za stejných experimentálních podmínek (spektra některých vzorků obratlovců (např. Knightia) vykazují velmi slabé preedge rysy, které však lze hůře interpretovat jako jednoznačný důkaz Cu(I)). Případně by příspěvek Cu(I) v očních tkáních hlavonožců mohl pocházet z deoxygenovaného hemocyaninu, respirační molekuly hlavonožců. Spektrum XANES z Tullimonstrum vykazuje dominantní pík při 8994,38 eV a výrazný preedge rys při 8987,8-8990,2 eV. Tyto rysy odpovídají příspěvkům z více oxidačních stavů Cu, včetně výrazného příspěvku Cu(I) , stejně jako u extantních a fosilních hlavonožců.

Diskuse

Naše studie ukazuje, že oči extantních hlavonožců mají melanosomy s tkáňově specifickou geometrií. Kolaps oka hlavonožců během rozpadu by mohl potenciálně vytvářet velikostně specifické vrstvy melanosomů povrchově podobné těm v RPE obratlovců (obr. 1a,b). Přítomnost melanosomů s tkáňově specifickou velikostí a/nebo geometrií v očích současných hlavonožců (obr. 2a,c) proto naznačuje, že postupné vrstvy melanosomů různých velikostí a/nebo geometrií ve fosiliích nelze automaticky interpretovat jako důkaz RPE obratlovců. Není známo, do jaké míry se u jiných skupin fosilních bezobratlých zachovaly oční melanosomy (chemické důkazy melaninu v očích fosilního hmyzu viz Lindgren et al.).

Melanin v očích současných obratlovců může vázat různé prvky, jejichž relativní množství se může měnit v závislosti na biologických a environmentálních faktorech . U obratlovců může melanin sekvestrovat ionty kovů, čímž potenciálně zabraňuje oxidačnímu poškození tkání . Ve srovnání s obratlovci vykazují oči hlavonožců nízké koncentrace kovů v melanizovaných tkáních (obr. 3a,b). To pravděpodobně odráží relativně nízké množství melaninu (elektronický doplňkový materiál, tabulka S2) a naznačuje, že za prevenci poškození tkání v důsledku expozice iontům kovů u hlavonožců jsou zodpovědné jiné než melaninové cesty, tj. funkce melaninu v očích hlavonožců se liší od funkce melaninu u obratlovců. Rozdíly v obsahu melaninu v očích existujících obratlovců (elektronický doplňkový materiál, tabulka S2) by mohly potenciálně odrážet rozdíly v ekologii a/nebo světelném prostředí.

Naše chemické údaje o existujících obratlovcích a hlavonožcích ukazují, že variabilita mezi jednotlivými klany je výrazně větší než v rámci obou skupin (obr. 3a-d). Melanizované tkáně v očích extantních obratlovců jsou obohaceny o Zn (obr. 4a,b) a ve spektrech XANES vykazují silný signál Cu(II) (obr. 4c); naproti tomu melanizované tkáně u extantních hlavonožců mají nízký obsah Zn a vykazují smíšený příspěvek Cu(I) a Cu(II). Podobně oční melanosomy u Tullimonstrum mají nízký obsah Zn ve srovnání s melanosomy u obratlovců z Mazon Creeku a XANES spektra ukazují na přítomnost Cu(I). Oční skvrny u Pohlsepia se však neshodují s Tullimonstrum ani s obratlovci Mazon Creek v chemosféře LDA. Chemismus jednoznačných obratlovců a hlavonožců v Mazon Creeku tedy neodpovídá obecnému vzorci obohacení prvků u moderních hlavonožců a obratlovců. Souhrnně lze říci, že údaje o morfologii a chemismu melanosomů nejsou zcela v souladu s příbuzností obratlovců s Tullimonstrum. Příbuznost s bezobratlými nelze vyloučit, ale příbuznost s hlavonožci je nepravděpodobná vzhledem k absenci dalších diagnostických morfologických znaků .

Je známo, že chemická struktura melaninu se mění v důsledku změn pH a vystavení zvýšeným koncentracím kovů , tlakům a teplotám, které se běžně vyskytují během diageneze. Je proto pravděpodobné, že melanosomy u různých fosilních taxonů ze stejných nebo různých biot mohou procházet různými diagenetickými cestami, což vede k rozdílným chemickým složením stopových prvků (jak je patrné ze studií organické geochemie fosilních melaninů ). Zde pozorované chemické rozdíly mezi fosiliemi (obr. 3e-h) pravděpodobně odrážejí rozdíly v hostitelské litologii a/nebo diagenetické historii. Například nepřítomnost zachovaných melanosomů v Pohlsepii naznačuje, že tento exemplář prošel během diageneze rozsáhlejší alterací než ostatní analyzované fosilní exempláře. Dále jsou rozdíly v chemismu stopových prvků mezi fosiliemi z Mazon Creeku větší než u fosilií ze všech ostatních biot. To naznačuje, že chemická diageneze melanosomů ve fosiliích z Mazon Creeku je variabilnější než u ostatních biot, což znemožňuje jednoznačnou interpretaci původního chemismu stopových prvků. Nicméně oči Knightia a exemplář Tetradontiformes indet. mají podobné signatury stopových kovů, přestože pocházejí z různých biot, a mají tedy pravděpodobně odlišnou diagenetickou historii. Budoucí studie zaměřené na reakci chemismu stopových prvků melanosomů na různé diagenetické faktory, např. pH, litologii, tlak a teplotu, budou mít zásadní význam pro rozlišení původního chemismu od chemických produktů diageneze.

Dostupnost dat

Všechna data poskytujeme v hlavním textu, elektronickém doplňkovém materiálu nebo prostřednictvím digitálního repozitáře Dryad: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Příspěvky autorů

C.S.R. a T.I.A. provedli histologii; C.S.R., T.I.A. a M.E.M. provedli SEM; C.S.R., M.E.M. a S.M.W. provedli synchrotronové rychlé skenování – rentgenovou fluorescenci a rentgenovou absorpční spektroskopii (XAS); S.I. a K.W. provedli analýzy AHPO; C.S.R. a M.E.M. napsali rukopis za přispění všech ostatních autorů.

Konkurenční zájmy

Autoři nehlásí žádné konkurenční zájmy.

Financování

Podpořeno grantem European Research Starting Grant (grant č. ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) uděleným M.E.M. Využití Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, je podporováno Ministerstvem energetiky USA, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences na základě smlouvy č. 1. DE-AC02-76SF00515.

Poděkování

Děkujeme A. Aaseovi, S. Gabbottovi, Z. Hughesovi, R. Gainesovi, B. Lindowovi, P. Mayerovi, D. Mikulicovi, W. Simpsonovi a A. Stroupovi za přístup ke vzorkům; N. Edwardsovi za podporu XAS; V. Rossimu a R. Wogeliusovi za diskusi.

Poznámky

Elektronický doplňkový materiál je k dispozici online na adrese https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. Všechna práva vyhrazena.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015Jak vzniká složitost: evoluce očí živočichů. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016Oči Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, karbon) odhalují příbuznost s obratlovci. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Comparisons of the structural and chemical properties of melanosomes isolated from retinal pigment epithelium, iris and choroid of newborn and mature bovine eyes. Photochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012Intraokulární distribuce melaninu v lidských, opičích, králičích, miniprasatích a psích očích. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optická koherentní tomografie světlem řízené translokace melanosomů v pigmentovém epitelu sítnice. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000Evoluce očí. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogeneze v inkoustové žláze Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fine structure of melanogenesis in the ink sac of Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolysis reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002Užitečnost 4-amino-3-hydroxyfenylalaninu jako specifického markeru pro feomelanin. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissue-specific geometry and chemistry of modern and fossilized melanosomes reveal internal anatomy of extinct vertebrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analyse histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: softwarový balík paleontologické statistiky pro vzdělávání a analýzu dat. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011Soubor nástrojů pro mikroanalýzu: X-ray fluorescence image processing software. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: analýza dat pro rentgenovou absorpční spektroskopii pomocí IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S0909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Immunoelektron-mikroskopická studie distribuce G-proteinu na fotoreceptorových buňkách hlavonožce Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987X-ray absorption edge determination of the oxidation state and coordination number of copper: application to the type 3 site in Rhus vernicifera Laccase and its reaction with oxygen (Stanovení oxidačního stavu a koordinačního čísla mědi pomocí absorpční hrany rentgenového záření: aplikace na místo typu 3 v lakase Rhus vernicifera a její reakce s kyslíkem). J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse immune functions of hemocyanins. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al.. 2019Fosilní hmyzí oči vrhají světlo na optiku trilobitů a pigmentovou clonu členovců. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Fyzikální a chemická charakterizace melanosomů duhovky a cévnatky izolovaných z novorozených a dospělých krav. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017The ‚Tully Monster‘ is not a vertebrate: characters, convergence and taphonomy in Palaeozoic problematic animals. Palaeontology 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. In Mazon creek fossils (ed. Nitecki MH), pp. 269-301. Zkameněliny z Mazonského potoka (ed. Nitecki MH). New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. In The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitivní měkkotělní hlavonožci z kambria. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorpce Pb(II) a Cd(II) melaninem olihně Ommastrephes bartrami. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically altered melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Data from: Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopods: implications for the affinity of Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar

.