Spectroscopia de absorbție cu raze X de sincrotron a melanozomilor la vertebrate și cefalopode: implications for the affinity of Tullimonstrum

Introducere

Pigmenții de ecranare sunt o componentă esențială a sistemelor vizuale la animale, deoarece absorb lumina eronată, permițând astfel fotorecepția direcțională și protecția fotoreceptorilor de radiațiile ultraviolete . Pigmenții de ecranare la nevertebrate includ ommocromii, pterinele și, mai rar, melanina . În schimb, principalul pigment de ecranare la vertebrate este melanina, care apare sub formă de melanosomi (organite legate de membrană) în iris, coroidă, epiteliul pigmentat al retinei (RPE) și scleră (figura 1). Melanozomii RPE includ forme sferice și alungite care sunt împărțite spațial . În cazul unei lumini incidente puternice, melanozomii alungite migrează către procesele apicale ale celulelor RPE, protejând astfel pigmenții fotosensibili din celulele fotoreceptoare de albire. În mod intrigant, ochii taxonului enigmatic Tullimonstrum gregarium (Carboniferous, Mazon Creek, IL, SUA) prezintă, de asemenea, straturi succesive de melanozomi de geometrii diferite. Această trăsătură a fost interpretată ca o dovadă a unei afinități vertebrate pe baza unei analize a distribuției și morfologiei melanozomilor la animalele existente . Cu toate acestea, nu se știe dacă melanozomii din ochii nevertebratelor sunt organizați în straturi tisulare succesive ca la vertebrate. Rezolvarea acestui aspect necesită investigarea sistematică a pigmenților de screening în ochii nevertebratelor. Cefalopodele sunt un caz de testare ideal, deoarece, la fel ca vertebratele, posedă un ochi complex de tip cameră cu mai multe straturi de țesut pigmentat și se știe că produc melanozomi (în sacul de cerneală ). Am caracterizat în mod sistematic localizarea anatomică și chimia țesuturilor pigmentate, precum și geometria granulelor de pigment, în ochii caracatiței comune (Octopus vulgaris), ai calmarului european (Loligo vulgaris), ai sepiei comune (Sepia officianalis), ai lamprei de mare (Petromyzon marinus) și ai bibanului european (Dicentrachus labrax), cuplate cu date din fosile (material electronic suplimentar, tabelul S1). Țesuturile au fost analizate cu ajutorul colorației histologice Warthin-Starry, al oxidării cu peroxid de hidrogen alcalin (AHPO ) și al microscopiei electronice cu scanare (SEM). În ochii vertebratelor exante, melanina reduce stresul oxidativ prin chelarea ionilor metalici, iar lucrări recente arată că melanozomii vertebratelor au chimii de oligoelemente specifice pentru fiecare țesut în parte . Prin urmare, am testat dacă chimia oligoelementelor poate discrimina melanozomii ochilor de vertebrate și de cefalopode utilizând spectroscopia de fluorescență cu raze X cu scanare rapidă de sincrotron (SRS-XRF) și spectroscopia de absorbție cu raze X în apropierea structurii de margine (XANES).

Figura 1. Anatomia ochilor de cefalopode și vertebrate existente. Ilustrații schematice ale (a) ochiului de cefalopod și (b) ochiului de vertebrate cu, inserție, detalii ale straturilor de țesut. (c) Secțiuni histologice și micrografii electronice de scanare (SEM) ale ochilor la Loligo, Octopus, Sepia și Petromyzon. Secțiunile sunt colorate cu Warthin-Starry; melanina apare neagră. Toate țesuturile prezintă microcorpi asemănători melanosomului. C, coroidă; I/săgeți negre, iris; L, cristalin; O, nervul optic; OG, ganglionii nervului optic; R, retină; RPE/*, epiteliul pigmentar al retinei; RPL/săgeți, stratul pigmentat al retinei; S/săgeată albă, scleră; SCL, stratul subciliar; V, umorul vitros. (Versiunea online în culori.)

Materiale și metode

(a) Exemplare moderne și fosile

Specimene de Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon și Dicentrachus (fiecare n = 5) au fost obținute de la furnizori comerciali (Ballycotton Seafoods și K O’Connell Fish Merchants (English Market din Cork, Republica Irlanda) și Online Baits UK). Lampiile au fost furnizate congelate și au fost disecate imediat după decongelare; cefalopodele și bibanul european erau decedate în momentul achiziției și au fost disecate în termen de 24 de ore de la moarte. Ochii au fost fixați în glutaraldehidă 2,5 % timp de 1 oră la temperatura camerei, deshidratați în etanol și depozitați în etanol 70 % înainte de analize ulterioare.

Acest studiu include analiza punctelor oculare ale următoarelor opt fosile: din Mazon Creek, două specimene de Tullimonstrum (CKGM F 6426 și FMNH PE 22061), câte un specimen de vertebrate Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) și Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) și singurul specimen de cefalopod fosil Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); din Green River (Eocen, Colorado/Utah/Wyoming), un specimen de Knightia sp. (FOBU 17591) și din Formațiunea Fur (Eocen, Danemarca) un exemplar nedeterminat de Teterodontiformes (NHMD 199838); din Hâkel și Hâdjoula Lagerstätte (Cretacicul târziu, Liban), caracatița fosilă Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Abrevieri instituționale: NHMUK, Muzeul de Istorie Naturală din Londra; NHMD, Muzeul de Istorie Naturală din Danemarca; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Oxidare cu peroxid de hidroxid alcalin și hidroliză cu acid hidroiodic

Tesuturile au fost disecate cu ajutorul unor instrumente sterile, plasate în flacoane de sticlă, liofilizate și pulverizate. Coroida și RPE de vertebrate nu au putut fi separate și, prin urmare, au fost tratate ca un singur țesut în această analiză. Eșantioanele de țesut liofilizate (9-17 mg) au fost omogenizate în apă cu un omogenizator Ten-Broeck la o concentrație de 10 mg ml-1 , iar alicote de 100 µl sau 200 µl au fost procesate folosind AHPO și hidroliza cu acid hidroiodic . AHPO după hidroliza HCl testează prezența acidului pirrol-2,3,5-tricarboxilic (un marker pentru eumelanină); analiza cu acid hidroiodic testează prezența 4-amino-3-hidroxilfenilalaninei (un marker pentru feomelanină).

(c) Histologie

Eșantioane disecate de țesuturi din ochi de cefalopode și coroidă, iris, RPE și scleră din ochi de vertebrate au fost fixate cu glutaraldehidă 2,5% timp de 1 h la temperatura camerei. Eșantioanele de țesut fixate au fost prelucrate pentru histologie și colorate folosind protocolul Warthin-Starry, care testează prezența melaninei .

(d) Microscopie electronică de scanare

Eșantioane mici (aprox. 1-2 mm2) de țesut ocular au fost uscate folosind hexametildisilazan sau azot lichid. Probele de țesut uscate și secțiunile subțiri decopertate au fost montate pe butuci de aluminiu, acoperite prin pulverizare cu aur/paladiu și au fost imaginate la o tensiune de accelerare de 5-15 keV folosind un SEM FEI Quanta 650 și un SEM Zeiss Gemini Supra 40. Analizele de spectroscopie cu raze X cu dispersie de energie (EDS) au fost efectuate cu ajutorul unui VP-SEM Hitachi S-3500N VP-SEM echipat cu un spectrometru cu dispersie de energie EDAX Genesis la o tensiune de accelerare de 15 kV, cu timpi de achiziție de 120 s pentru hărțile EDS (material electronic suplimentar, figura S1).

(e) Analiza geometriei și dimensiunii melanozomilor

Datele de geometrie au fost măsurate pentru cel puțin 20 de melanozomi (și, dacă este cazul, microcorpi asemănători melanozomilor) pentru fiecare țesut din fiecare specimen. Diferențele de geometrie au fost testate cu ajutorul ANOVA sau (în cazul în care datele sunt heteroscedastice) cu testul F de Welch cuplat cu analiza post hoc pe perechi în PAST (Tukey pentru ANOVA și, respectiv, Dunn pentru analizele F de Welch) . Datele privind geometria melanozomului pentru S. officianalis sunt homoscedastice, dar nenormale și, prin urmare, au fost analizate post-transformare logaritmică.

(f) Fluorescența cu raze X cu scanare rapidă de sincrotron

Măsurătorile au fost efectuate la liniile de fascicule 2-3 și 10-2 de la Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). Energia incidentă a razelor X a fost setată la 11 keV folosind un monocromator cu dublu cristal Si (111), cu inelul de stocare conținând 500 mA în modul top-off la 3,0 GeV. La linia de fascicule 2-3, un fascicul microfocalizat de 2 × 2 µm a fost furnizat de o pereche de oglinzi Kirkpatrick-Baez acoperite cu Rh, în timp ce linia de fascicule 10-2 a utilizat deschideri de tungsten pentru a obține dimensiuni selectabile ale fasciculului între 25 și 200 µm. Intensitatea razelor X incidente la fiecare linie de fascicule a fost măsurată cu o cameră de ioni umplută cu azot. Eșantioanele au fost montate la 45° față de fasciculul de raze X incident și au fost rasete spațial pentru un timp de rezidență de 20-50 ms pixel-1 . La linia de fascicule 2-3 au fost cartografiate următoarele: secțiuni subțiri neacoperite și necolorate de ochi de la un individ de Dicentrachus și Octopus și de la doi indivizi de Loligo și Petromyzon; ochișoarele unui specimen de Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. și Teterodontiformes indet. La linia de fascicul 10-2 au fost cartografiate următoarele: al doilea specimen de Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia și eșantioane de țesuturi moi de la Keuppia sp. Cele două linii de fascicul diferite au fost utilizate pentru a găzdui eșantioane/specimeni de dimensiuni diferite (eșantioanele prea mari pentru etapa de eșantionare de la linia de fascicul 2-3 au fost găzduite la 10-2). Datele privind fosilele din fiecare linie de fascicul au fost calibrate în raport cu același set de standarde și, prin urmare, variațiile datelor sunt reale și nu reflectă variații ale parametrilor analitici. Întregul spectru de fluorescență a fost colectat la fiecare punct de date, iar intensitatea liniilor de fluorescență pentru elementele selectate (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu și Zn) a fost monitorizată cu ajutorul unui detector Vortex cu drift de siliciu (Hitachi, SUA) cuplat la un sistem de procesare a impulsurilor Xpsress3 (Quantum Detectors) pentru discriminarea energiei. Intensitățile de fluorescență au fost corectate pentru timpul mort al detectorului și normalizate în raport cu fluxul de intrare (I0STRM). Concentrațiile fiecărui element în µg cm-2 au fost calibrate cu ajutorul etaloanelor elementale cu peliculă subțire trasabile NIST. Prelucrarea datelor a fost realizată cu ajutorul software-ului MicroAnalysis Toolkit . S-au calculat valorile mediei și deviației standard pentru concentrațiile fiecărui element în regiunile de interes selectate. Diferențele de concentrații elementare între regiunile de interes au fost evaluate cu ajutorul analizei discriminante liniare (LDA) în PAST . Datele au fost grupate folosind un singur nivel de clasificare care corespunde țesutului de origine, de exemplu: Octopus retinal pigmented layer (RPL), Petromyzon iris, Petromyzon sclera, FMNH PE 22061 eyespot, etc. Analiza în componente principale a datelor produce o distribuție a datelor care este aproape identică cu LDA (material electronic suplimentar, figura S4a,b).

(g) Spectroscopia de absorbție a razelor X în apropierea structurii de margine

Spectrele XANES au fost colectate la beamline 2-3 de la SSRL din punctele de interes identificate în hărțile XRF. Acest lucru a fost realizat prin conducerea energiei fasciculului incident prin muchia K a Cu K în mod gradat și înregistrarea intensității emise a liniei Kα în funcție de energia incidentă . Calibrarea energiei monocromatorului a fost realizată cu ajutorul unei folii de Cu. Spectrometrii XANES au fost obținuți din RPL și sclera lui Loligo, coroida lui Petromyzon și din punctele oculare din specimenul de Tetradontiformes indet., Knightia și Tullimonstrum (CKGM F 6426). Spectrele au fost prelucrate cu ajutorul pachetului software Athena .

Rezultate

(a) Melanina și melanosomii în ochii cefalopodelor și vertebratelor exante

În mod neașteptat, mai multe straturi de țesut distincte din ochii tuturor cefalopodelor studiate prezintă o colorare neagră, specifică melaninei (figura 1). Aceste date sunt susținute de analizele AHPO, care confirmă faptul că țesuturile colorate ale Loligo, Octopus și Sepia sunt bogate în eumelanină și, într-o măsură mai mică, în feomelanină (material electronic suplimentar, tabelul S2). Analiza SEM a țesuturilor bogate în melanină confirmă prezența microcorpilor sferoizi/oblongi (a se vedea, de asemenea ; figura 1). Este foarte puțin probabil ca microcorpii să reprezinte bacterii de putrefacție, deoarece aceștia apar în ochii intacți ai specimenelor proaspăt ucise, fără semne de deteriorare a țesuturilor, prezintă o stratificare specifică mărimii constantă între specimenele din același taxon și sunt stabili sub fasciculul de electroni. Mai mult, este puțin probabil ca microcorpii să reprezinte granule de omocrom, deoarece aceștia apar în straturi de țesut care se colorează pozitiv pentru melanină în secțiunile histologice și conțin markeri de diagnostic pentru eumelanină în analizele AHPO. Nu sunt prezenți alți microcorpi care ar putea genera aceste rezultate. Astfel, microcorpii din straturile de țesut care se colorează în negru în secțiunile histologice ale ochilor de cefalopode sunt cel mai plauzibil interpretați ca melanosomi.

La cefalopodele exante, melanosomii apar în iris și în straturi de țesut suplimentare situate în partea din spate a ochiului (definit aici ca RPL) și în spatele irisului (definit aici ca strat subciliar (SCL); figura 1a,c). Toate cefalopodele studiate posedă un SCL, dar eșantioane de calitate histologică din acest țesut au putut fi obținute numai pentru Octopus. Melanozomii diferă semnificativ în geometrie între iris și RPL atât la Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3), cât și la Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (figura 2a,c). Diferențele în geometria melanozomilor oculari din Octopus și Petromyzon sunt semnificative din punct de vedere statistic pentru unele, dar nu pentru toate populațiile de melanozomi (figura 2b,d; material electronic suplimentar, tabelul S4). În plus față de melanosomi, retina cefalopodelor conține granule subangulare abundente, de formă neregulată (figura 1c). Această geometrie nu este în concordanță cu cea a melanosomilor cunoscuți la vertebrate și cefalopode; granulele pot reprezenta astfel ommatine sau alți pigmenți fotosensibili, dar identitatea lor nu a fost încă demonstrată chimic. Diferite țesuturi din ochiul lamprei și al bibanului se colorează pentru eu- și feomelanină (figura 1b,c); analiza AHPO confirmă prezența melaninei în aceste țesuturi și demonstrează o variație marcată a concentrațiilor de eumelanină între ochii celor două vertebrate (material electronic suplimentar, tabelul S2).

Figura 2. Geometria melanozomilor din ochi. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia și (d) Petromyzon.

În rezumat, datele noastre arată că melanozomii din diferite țesuturi ale ochiului au geometrii semnificativ diferite atât la cefalopodele exante, cât și la vertebrate (material electronic suplimentar, tabelele S3 și S4; figura 2).

(b) Chimia melanozomilor oculari

Am folosit SRS-XRF și XANES pentru a testa dacă chimia urmelor de metale poate distinge melanozomii oculari ai vertebratelor de cei ai cefalopodelor. În ochii calmarilor și caracatițelor existente, doar Cu prezintă o partiționare spațială izbitoare (figura 3a,b): este îmbogățit în scleră, dar nu și în RPL bogat în melanină (sau în alte țesuturi). Zn prezintă o repartiție subtilă în ambii taxoni de cefalopode analizați: este ușor îmbogățit în RPL al caracatiței și, într-o măsură mai mică, în sclera calmarului. Cu toate acestea, la vertebrate, țesuturile purtătoare de melanozomi prezintă o repartiție izbitoare a Zn (și, la lamprei, Fe și Cu) (figura 3c,d). La lamprei, Fe este îmbogățit în iris; Zn este îmbogățit în iris și, în special, în coroidă și RPE, iar Cu este îmbogățit în toate țesuturile purtătoare de melanosomi. La biban, Zn este îmbogățit în toate țesuturile purtătoare de melanosomi. În hărțile XRF ale ochilor de vertebrate existente, coroida și RPE nu pot fi diferențiate cu ajutorul chimiei oligoelementelor sau al ultrastructurii, ceea ce face necesară tratarea lor ca un singur țesut. Nu considerăm că acest lucru afectează rezultatele noastre principale, deoarece datele noastre de la cefalopode și de la alte țesuturi oculare de vertebrate arată că variația chimică intraspecifică este minoră în raport cu variația interspecifică (figura 4a,b). Țesuturile bogate în melanozomi din ochii vertebratelor existente, dar nu și a cefalopodelor, sunt astfel îmbogățite în Zn (și uneori Fe și Cu) în raport cu alte țesuturi oculare.

Figura 3. Analiza SRS-XRF a secțiunilor histologice de Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) și Dicentrachus (d), precum și de vertebrate fosile (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) și Knightia (f), cefalopode fosile Keuppia (g) și Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Secțiunile histologice sunt colorate cu Warthin-Starry; melanina apare neagră. Hărțile SRS-XRF din (a-h) corespund regiunilor prezentate în secțiunile histologice și în fotografii. A se vedea materialul electronic suplimentar, figura S2 pentru locațiile regiunilor din fotografiile secțiunilor histologice și pentru locațiile regiunilor din fotografiile fosilelor prezentate. Săgeți negre, iris; vârfuri de săgeată, RPL; asterisc, RPE; săgeți albe, scleră. Valorile concentrației maxime pentru fiecare hartă SRS-XRF sunt furnizate în materialul electronic suplimentar, tabelul S5. (Versiunea online în culori.)

Figura 4. Chimia oligoelementelor la cefalopodele și vertebratele existente și fosile și la Tullimonstrum. (a) LDA pe baza concentrațiilor măsurate de Ti, Fe, Cu și Zn. (b) Biplot al elementelor cheie care contribuie la variația din (a). (c) Spectrele XANES ale specimenelor selectate și ale standardelor la marginea Cu K (linia punctată la 8987 eV). Variația mai mare a chimiei dintre Tullimonstrum și alte fosile din Mazon Creek prezentă în (a) în raport cu variația dintre alte biote fosile este prezentă chiar și atunci când Fe este eliminat din setul de date (material electronic suplimentar, figura S4c,d). Vârfurile de săgeată din (c) indică poziția trăsăturilor de pre-edge în aceste spectre. Datele pentru sacul de cerneală al calmarului fosil sunt din .

Pentru a testa dacă acest semnal persistă în fosile, am analizat punctele oculare la două cefalopode fosile și patru vertebrate fosile. Cu excepția cefalopodului Pohlsepia din Mazon Creek, punctele oculare din toate specimenele conțin microcorpi asemănători melanosomului (material electronic suplimentar, figura S3). Hărțile SRS-XRF arată că punctele oculare de la vertebratele fosile Knightia și Tetradontiformes indet. (figura 3e-f) sunt îmbogățite în Ti și Cu în raport cu matricea sedimentară, cu o îmbogățire minoră de Zn în cea din urmă. În schimb, pata oculară de la Keuppia este relativ îmbogățită doar în Ti, Fe și Zn (figura 3g). Ochiul de la Tullimonstrum este îmbogățit în Ti, Fe, Cu și Zn în raport cu țesuturile moi înconjurătoare (figura 3h). Aceste date chimice nu sunt pe deplin în concordanță cu semnalul din cefalopodele fosile studiate sau din vertebratele fosile.

Am folosit LDA pentru a explora variația concentrațiilor elementelor cheie Ti, Fe, Cu și Zn în setul nostru de date. Țesuturile oculare de la vertebrate și cefalopode existente se trasează în regiuni separate de chemospațiu și separat de omologii lor fosili (figura 4a,b). În mod critic, chimia oligoelementelor din ochiul vertebratelor neechivoce din Pârâul Mazon este distinctă de cea a ambelor exemplare de Tullimonstrum, care se trasează aproape unul de celălalt. Separarea vertebratelor neechivoce din Mazon Creek de cele din Tullimonstrum de-a lungul axei LD2 reflectă îmbogățirea primelor în Zn și, într-o măsură mai mică, în Cu și Fe: în mod curios, acest lucru reflectă variația în chimie între vertebratele și cefalopodele existente. Punctele oculare ale lui Tullimonstrum sunt, totuși, distincte din punct de vedere chimic de cele ale lui Pohlsepia, un cefalopod fără echivoc din Mazon Creek.

Am explorat variația stării de oxidare a Cu, un metal asociat în mod obișnuit cu melanina , în taxoni fosili și moderni selectați, folosind XANES. Spectrele XANES la marginea Cu K prelevate din coroida lamprei și din două pete oculare de vertebrate fosile prezintă toate vârfuri de absorbție centrate la 8994 ± 1 eV, indicând contribuții puternice de la Cu(II) (figura 4c). Spectrele de la RPL de calmar (melanizat) și sclera (nemelanizat) se aseamănă în linii mari cu cele de la vertebrate, dar prezintă caracteristici de precorduri la 8978,59 eV și, respectiv, 8977,58 eV, ale căror poziții dezvăluie prezența Cu(I) . În spectrul de la Keuppia apare o caracteristică pre-edge care se întinde între 8976,73-8984,27 eV, reflectând, de asemenea, o contribuție a Cu(I). Prezența Cu(I) în spectrele XANES ale punctelor oculare ale cefalopodelor existente și fosile ar putea reflecta o reducere a Cu(II) în timpul analizei. Cu toate acestea, eșantioanele de vertebrate nu prezintă nicio contribuție din partea Cu(I), deși au fost analizate în condiții experimentale identice (spectrele pentru unele eșantioane de vertebrate (de exemplu, Knightia) prezintă trăsături foarte slabe de precorduri, dar acestea sunt mai puțin ușor de interpretat ca dovadă neechivocă pentru Cu(I)). Alternativ, contribuțiile Cu(I) în țesuturile oculare ale cefalopodelor ar putea proveni din hemocianina deoxigenată, molecula respiratorie a cefalopodelor. Spectrul XANES de la Tullimonstrum demonstrează un vârf dominant la 8994,38 eV și o caracteristică proeminentă de pre-bord la 8987,8-8990,2 eV. Aceste caracteristici sunt în concordanță cu contribuții din mai multe stări de oxidare a Cu, inclusiv o contribuție distinctă a Cu(I) , ca și în cazul cefalopodelor existente și fosile.

Discuție

Studiul nostru arată că ochii cefalopodelor existente posedă melanozomi cu geometrii specifice țesutului. Prăbușirea ochiului cefalopodelor în timpul descompunerii ar putea genera, potențial, straturi de melanozomi de dimensiuni specifice, asemănătoare superficial cu cele din RPE al vertebratelor (figura 1a,b). Prezența melanozomilor cu dimensiuni și/sau geometrii specifice țesutului în ochii cefalopodelor existente (figura 2a,c) indică, prin urmare, faptul că straturile succesive de melanozomi de dimensiuni și/sau geometrii diferite din fosile nu pot fi interpretate în mod automat ca dovadă a existenței RPE la vertebrate. Măsura în care alte grupuri de nevertebrate fosile păstrează melanozomii din ochi este necunoscută (dar a se vedea Lindgren et al. pentru dovezi chimice privind prezența melaninei în ochii insectelor fosile).

Melanina din ochii vertebratelor existente poate lega diferite elemente, a căror abundență relativă poate varia în funcție de factorii biologici și de mediu . La vertebrate, melanina poate sechestra ioni metalici, prevenind potențial deteriorarea oxidativă a țesuturilor . Comparativ cu vertebratele, ochii cefalopodelor prezintă concentrații scăzute de metale în țesuturile melanizate (figura 3a,b). Acest lucru reflectă probabil abundența relativ scăzută a melaninei (material electronic suplimentar, tabelul S2) și sugerează că alte căi decât melanina sunt responsabile pentru prevenirea deteriorării țesuturilor în urma expunerii la ioni metalici la cefalopode, adică funcția melaninei în ochii cefalopodelor diferă de cea de la vertebrate. Variația conținutului de melanină în ochii vertebratelor exante (material electronic suplimentar, tabelul S2) ar putea reflecta, potențial, variații în ecologie și/sau în habitatul luminos.

Datele noastre chimice privind vertebratele și cefalopodele exante arată că variația inter-clasă este semnificativ mai mare decât cea din cadrul oricăruia dintre grupuri (figura 3a-d). Țesuturile melanizate din ochii vertebratelor exante sunt îmbogățite în Zn (figura 4a,b) și prezintă un semnal puternic de Cu(II) în spectrele XANES (figura 4c); în schimb, țesuturile melanizate din cefalopodele exante sunt sărace în Zn și prezintă o contribuție mixtă din partea Cu(I) și Cu(II). În mod similar, melanozomii oculari din Tullimonstrum sunt săraci în Zn în raport cu cei din vertebratele din Mazon Creek, iar spectrele XANES indică prezența Cu(I). Cu toate acestea, petele oculare de la Pohlsepia nu se identifică cu Tullimonstrum sau cu vertebratele din Mazon Creek în LDA chemospace. Chimia vertebratelor și a cefalopodelor fără echivoc din Mazon Creek nu se potrivește, așadar, cu modelul general de îmbogățire a elementelor la cefalopodele și vertebratele moderne. În mod colectiv, datele privind morfologia și chimia melanosomului nu sunt pe deplin compatibile cu o afinitate a vertebratelor pentru Tullimonstrum. O afinitate pentru nevertebrate nu poate fi exclusă, dar o afinitate pentru cefalopode nu este plauzibilă, având în vedere absența altor caractere morfologice de diagnosticare.

Se știe că structura chimică a melaninei este modificată de schimbările de pH și de expunerea la concentrații ridicate de metale , presiuni și temperaturi , toate acestea fiind frecvent întâlnite în timpul diagenezei. Prin urmare, este probabil ca melanozomii din diferiți taxoni fosili din aceleași biote sau din biote diferite să urmeze căi diagenetice diferite, rezultând astfel chimii disparate ale oligoelementelor (așa cum reiese din studiile privind geochimia organică a melaninelor fosile ). Variația chimică între fosile observată aici (figura 3e-h) reflectă probabil variația în litologia gazdei și/sau istoria diagenetică. De exemplu, absența melanozomilor conservați în Pohlsepia sugerează că acest specimen a suferit o alterare mai extinsă în timpul diagenezei decât celelalte specimene fosile analizate. Mai mult, variația în chimia oligoelementelor între fosilele din Mazon Creek este mai mare decât în cazul fosilelor din toate celelalte biote. Acest lucru sugerează că diageneza chimică a melanozomilor din fosilele din Mazon Creek este mai variabilă decât în cazul altor biote, împiedicând o interpretare concludentă a chimiei originale a oligoelementelor. Cu toate acestea, ochii de Knightia și specimenul de Tetradontiformes indet. au semnături similare ale oligoelementelor, deși provin din biote diferite și, prin urmare, se presupune că au istorii diagenetice diferite. Studiile viitoare care vizează răspunsul chimiei oligoelementelor din melanozomi la diverși factori diagenetici, de exemplu pH, litologie, presiune și temperatură, vor fi esențiale pentru discriminarea chimiei originale de produsele chimice ale diagenezei.

Accesibilitatea datelor

Furnizăm toate datele în textul principal, în materialul suplimentar electronic sau prin intermediul Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Contribuțiile autorilor

C.S.R. și T.I.A. au realizat histologia; C.S.R., T.I.A. și M.E.M. au realizat SEM; C.S.R., M.E.M. și S.M.W. au efectuat scanarea rapidă cu sincrotron – fluorescență cu raze X și spectroscopie de absorbție cu raze X (XAS); S.I. și K.W. au efectuat analizele AHPO; C.S.R. și M.E.M. au scris manuscrisul cu contribuția tuturor celorlalți autori.

Interesele concurente

Autorii declară că nu au interese concurente.

Finanțare

Sprijinit de European Research Starting Grant (grant nr. ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) acordat lui M.E.M. Utilizarea Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, este sprijinită de US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences în baza contractului nr. DE-AC02-76SF00515.

Recunoștințe

Le mulțumim lui A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson și A. Stroup pentru accesul la specimene; N. Edwards pentru sprijinul XAS; V. Rossi și R. Wogelius pentru discuții.

Footnotes

Materialul electronic suplimentar este disponibil online la https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. Toate drepturile rezervate.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015Cum își are originea complexitatea: evoluția ochilor animalelor. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. Syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016Ochii lui Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, Carboniferous) dezvăluie o afinitate cu vertebratele. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Compararea proprietăților structurale și chimice ale melanozomilor izolați din epiteliul pigmentar retinian, irisul și coroida ochilor bovinelor nou-născute și mature. Photochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012Distribuția intraoculară a melaninei în ochii umani, de maimuță, de iepure, de minipig și de câine. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optical coherence tomography of light-driven melanosome translocation in retinal pigment epithelium. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000Evoluția ochilor. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogeneza în glanda de cerneală a Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fine structure of melanogenesis in the ink sac of Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolysis reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002Utilitatea 4-amino-3-hidroxifenilalaninei ca marker specific pentru feomelanină. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissue-specific geometry and chemistry of modern and fossilized melanosomes reveal internal anatomy of extinct vertebrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analyse histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: pachet software de statistică paleontologică pentru educație și analiză de date. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011The microanalysis toolkit: Software de procesare a imaginilor de fluorescență cu raze X. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S0909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Studiul microscopic imunoelectronic al distribuției proteinei G pe celulele fotoreceptoare ale cefalopodului Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987Determinarea marginii de absorbție cu raze X a stării de oxidare și a numărului de coordonare a cuprului: aplicație la situsul de tip 3 din Rhus vernicifera Laccase și reacția sa cu oxigenul. J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse funcții imune ale hemocianinelor. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al.. 2019Ochii de insecte fosile aruncă lumină asupra opticii trilobiților și a ecranului pigmentar al artropodelor. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Caracterizarea fizică și chimică a melanozomilor de iris și coroidă izolați de la vaci nou-născute și mature. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017The „Tully Monster” is not a vertebrate: characters, convergence and taphonomy in Palaeozoic problematic animals. Palaeontology 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. În Mazon creek fossils (ed. Nitecki MH), pp. 269-301. New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. În The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, Marea Britanie: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitive soft-bodied cephalopods from the Cambrian. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorption of Pb(II) and Cd(II) by squid Ommastrephes bartrami melanin. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically alterated melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Date din: Spectroscopia de absorbție cu raze X sincrotronică a melanosomelor la vertebrate și cefalopode: implicații pentru afinitatea Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar

.