Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopods: implications for the affinity of Tullimonstrum

Introduction

Pigmenty ekranujące są istotnym składnikiem systemów wizualnych u zwierząt, ponieważ pochłaniają błędne światło, umożliwiając w ten sposób kierunkową fotorecepcję i ochronę fotoreceptorów przed promieniowaniem ultrafioletowym. Pigmenty ekranujące bezkręgowców obejmują ommochromy, pteryny i, rzadziej, melaninę . W przeciwieństwie do tego, podstawowym pigmentem ekranującym u kręgowców jest melanina, występująca w postaci melanosomów (organelli związanych z błoną) w tęczówce, naczyniówce, nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE) i twardówce (rysunek 1). Wśród melanosomów RPE występują formy kuliste i wydłużone, które są podzielone przestrzennie. W jasnym świetle padającym, wydłużone melanosomy migrują do wyrostków szczytowych komórek RPE, chroniąc w ten sposób światłoczułe pigmenty w komórkach fotoreceptorowych przed wybieleniem. Co intrygujące, oczy enigmatycznego taksonu Tullimonstrum gregarium (karbon, Mazon Creek, IL, USA) również wykazują kolejne warstwy melanosomów o różnej geometrii. Cecha ta została zinterpretowana jako dowód na pokrewieństwo z kręgowcami na podstawie przeglądu rozmieszczenia i morfologii melanosomów u zwierząt żyjących na wolności. Nie wiadomo jednak, czy melanosomy oka bezkręgowców są zorganizowane w kolejne warstwy tkanki, tak jak u kręgowców. Rozstrzygnięcie tej kwestii wymaga systematycznego badania pigmentów ekranujących w oczach bezkręgowców. Głowonogi są idealnym przypadkiem testowym, ponieważ, podobnie jak kręgowce, posiadają skomplikowane oko typu kamera z wieloma pigmentowanymi warstwami tkanek i wiadomo, że wytwarzają melanosomy (w woreczku atramentowym). Systematycznie charakteryzowaliśmy anatomiczną lokalizację i chemię pigmentowanych tkanek, oraz geometrię granulek pigmentu, w oczach ośmiornicy zwyczajnej (Octopus vulgaris), kałamarnicy europejskiej (Loligo vulgaris), mątwy zwyczajnej (Sepia officianalis), minoga morskiego (Petromyzon marinus) i labraksa europejskiego (Dicentrachus labrax), w połączeniu z danymi pochodzącymi ze skamieniałości (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S1). Tkanki analizowano przy użyciu barwienia histologicznego Warthin-Starry, utleniania alkalicznym nadtlenkiem wodoru (AHPO ) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). W oczach kręgowców extant, melanina zmniejsza stres oksydacyjny poprzez chelatowanie jonów metali, a ostatnia praca pokazuje, że melanosomy kręgowców mają specyficzne dla tkanki chemistry pierwiastków śladowych . Dlatego sprawdziliśmy, czy chemia pierwiastków śladowych może rozróżnić melanosomy oczu kręgowców i głowonogów przy użyciu synchrotronowego szybkiego skanowania fluorescencji rentgenowskiej (SRS-XRF) i spektroskopii absorpcji rentgenowskiej w pobliżu struktury krawędziowej (XANES).

Figura 1. Anatomia oczu wymarłych głowonogów i kręgowców. Schematyczne ilustracje (a) oka głowonoga i (b) oka kręgowca z, wstawką, szczegółami warstw tkanek. (c) Przekroje histologiczne i skaningowe mikrografy elektronowe (SEM) oczu u Loligo, Octopus, Sepia i Petromyzon. Przekroje są barwione Warthin-Starry; melanina wydaje się czarna. We wszystkich tkankach widoczne są mikropodia podobne do melanosomów. C, naczyniówka; I/czarne strzałki, tęczówka; L, soczewka; O, nerw wzrokowy; OG, zwoje nerwu wzrokowego; R, siatkówka; RPE/*, nabłonek pigmentowy siatkówki; RPL/ groty strzałek, warstwa pigmentowa siatkówki; S/biała strzałka, twardówka; SCL, warstwa podspojówkowa; V, szklistka. (Wersja online w kolorze.)

Materiał i metody

(a) Okazy współczesne i kopalne

Okazy Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon i Dicentrachus (każdy n = 5) uzyskano od dostawców komercyjnych (Ballycotton Seafoods i K O’Connell Fish Merchants (English Market w Cork, Republika Irlandii) oraz Online Baits UK). Minogi dostarczono w stanie zamrożonym i wypreparowano natychmiast po rozmrożeniu; głowonogi i labraksy były martwe w momencie zakupu i zostały wypreparowane w ciągu 24 godzin po śmierci. Oczy zostały utrwalone w 2,5% glutaraldehydzie przez 1 h w temperaturze pokojowej, odwodnione w etanolu i przechowywane w 70% etanolu przed dalszą analizą.

Niniejsze badania obejmują analizę oczodołów następujących ośmiu skamieniałości: z Mazon Creek, dwóch okazów Tullimonstrum (CKGM F 6426 i FMNH PE 22061), po jednym okazie kręgowców Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) i Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) oraz jedynego okazu kopalnego głowonoga Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); z Green River (eocen, Kolorado/Utah/Wyoming), jeden okaz Knightia sp. (FOBU 17591) oraz z formacji Fur (eocen, Dania) bliżej nieokreślony Teterodontiformes (NHMD 199838); z Hâkel and Hâdjoula Lagerstätte (późna kreda, Liban) kopalna ośmiornica Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Skróty instytucjonalne: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Natural History Museum of Denmark; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Alkaliczne utlenianie nadtlenkiem wodorotlenku i hydroliza kwasem jodowym

Tkanki zostały rozczłonkowane przy użyciu sterylnych narzędzi, umieszczone w szklanych fiolkach, liofilizowane i sproszkowane. U kręgowców naczyniówki i RPE nie można było oddzielić, dlatego w tej analizie traktowano je jako pojedynczą tkankę. Liofilizowane próbki tkanek (9-17 mg) homogenizowano w wodzie za pomocą homogenizatora Ten-Broeck w stężeniu 10 mg ml-1 i przetwarzano 100 µl lub 200 µl podwielokrotności przy użyciu AHPO i hydrolizy kwasem jodowym. AHPO po hydrolizie HCl bada obecność kwasu pirolo-2,3,5-trikarboksylowego (marker dla eumelaniny ); analiza kwasem hydrojodowym bada obecność 4-amino-3-hydroksylofenyloalaniny (marker dla feomelaniny ).

(c) Histologia

Wycinki tkanek z oczu głowonogów oraz naczyniówki, tęczówki, RPE i twardówki z oczu kręgowców zostały utrwalone przy użyciu 2,5% glutaraldehydu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Utrwalone próbki tkanki przetwarzano do badań histologicznych i barwiono przy użyciu protokołu Warthin-Starry, który bada obecność melaniny.

(d) Skaningowa mikroskopia elektronowa

Małe próbki (ok. 1-2 mm2) tkanki oka suszono przy użyciu heksametylodisilazanu lub ciekłego azotu. Wysuszone próbki tkanki i odsłonięte cienkie przekroje były montowane na aluminiowych króćcach, napylane złotem/palladem i obrazowane przy napięciu przyspieszającym 5-15 keV za pomocą FEI Quanta 650 SEM i Zeiss Gemini Supra 40 SEM. Analizy metodą spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS) przeprowadzono przy użyciu Hitachi S-3500N VP-SEM wyposażonego w spektrometr dyspersji energii EDAX Genesis przy napięciu przyspieszającym 15 kV z czasami akwizycji 120 s dla map EDS (elektroniczny materiał uzupełniający, rysunek S1).

(e) Analiza geometrii i wielkości melanosomów

Dane dotyczące geometrii zostały zmierzone dla co najmniej 20 melanosomów (i, w stosownych przypadkach, mikrobiomów podobnych do melanosomów) dla każdej tkanki w każdej próbce. Różnice w geometrii były testowane przy użyciu ANOVA lub (gdy dane są heteroscedastyczne) testu F Welcha w połączeniu z parami analiz post hoc w PAST (odpowiednio Tukey dla ANOVA i Dunn dla analizy F Welcha). Dane dotyczące geometrii melanosomów dla S. officianalis są homoscedastyczne, ale nienormalne i dlatego były analizowane po transformacji logarytmicznej.

(f) Synchrotronowa szybko skanująca fluorescencja rentgenowska

Pomiary przeprowadzono na liniach 2-3 i 10-2 w Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). Energia padającego promieniowania rentgenowskiego została ustawiona na 11 keV przy użyciu monochromatora dwukrystalicznego Si (111) z pierścieniem magazynującym zawierającym 500 mA w trybie top-off przy energii 3.0 GeV. Na linii 2-3 wiązka o mikroogniskowaniu 2 × 2 µm była dostarczana przez parę zwierciadeł Kirkpatrick-Baez z powłoką Rh, podczas gdy linia 10-2 wykorzystywała przysłony wolframowe, aby osiągnąć wybieralne rozmiary wiązki między 25 a 200 µm. Intensywność padającego promieniowania rentgenowskiego na każdej linii wiązki mierzono za pomocą komory jonowej wypełnionej azotem. Próbki były montowane pod kątem 45° do padającej wiązki promieniowania rentgenowskiego i były rastrowane przestrzennie przez czas przebywania 20-50 ms pixel-1. Na linii 2-3 odwzorowano: odsłonięte i nie wybarwione cienkie przekroje oczu jednego osobnika Dicentrachus i Octopus oraz dwóch osobników Loligo i Petromyzon; oczodoły jednego okazu Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. i Teterodontiformes indet. Na wiązce 10-2 odwzorowano: drugi okaz Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia oraz próbki tkanek miękkich Keuppia sp. Dwie różne wiązki wykorzystano w celu dostosowania próbek/okazów o różnych rozmiarach (okazy zbyt duże do etapu pobierania próbek na wiązce 2-3 zostały dostosowane na wiązce 10-2). Dane dotyczące skamieniałości z każdej linii zostały skalibrowane względem tego samego zestawu wzorców, a zatem różnice w danych są rzeczywiste i nie odzwierciedlają zmian w parametrach analitycznych. W każdym punkcie zbierano całe widmo fluorescencji i monitorowano intensywność linii fluorescencji dla wybranych pierwiastków (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu i Zn) za pomocą krzemowego dryfowego detektora Vortex (Hitachi, USA) sprzężonego z systemem przetwarzania impulsów Xpsress3 (Quantum Detectors) w celu dyskryminacji energetycznej. Intensywności fluorescencji zostały skorygowane o czas martwy detektora i znormalizowane w stosunku do strumienia wejściowego (I0STRM). Stężenia każdego pierwiastka w µg cm-2 były kalibrowane przy użyciu wzorców pierwiastków cienkowarstwowych identyfikowalnych przez NIST. Przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania MicroAnalysis Toolkit . Dla stężeń każdego pierwiastka w wybranych regionach zainteresowania obliczono wartość średnią i odchylenie standardowe. Różnice w stężeniach pierwiastków pomiędzy regionami zainteresowania oceniano przy użyciu liniowej analizy dyskryminacyjnej (LDA) w programie PAST . Dane zostały pogrupowane przy użyciu pojedynczego poziomu klasyfikacji odpowiadającego tkance pochodzenia, np. warstwa barwnikowa siatkówki ośmiornicy (RPL), tęczówka Petromyzon, twardówka Petromyzon, plamka oczna FMNH PE 22061 itd. Analiza składowych głównych danych daje rozkład danych, który jest prawie identyczny z LDA (elektroniczny materiał uzupełniający, rysunek S4a,b).

(g) Rentgenowska absorpcyjna spektroskopia struktury bliskiej krawędzi

Widma XANES zostały zebrane na linii 2-3 w SSRL z punktów zainteresowania zidentyfikowanych na mapach XRF. Uzyskano to poprzez stopniowe przepuszczanie energii wiązki padającej przez krawędź Cu K i rejestrację intensywności emitowanej linii Kα w funkcji energii padającej. Kalibrację energii monochromatora uzyskano za pomocą folii Cu. Widma XANES uzyskano z RPL i twardówki Loligo, naczyniówki Petromyzon oraz z oczodołów okazów Tetradontiformes indet., Knightia i Tullimonstrum (CKGM F 6426). Widma zostały przetworzone przy użyciu pakietu oprogramowania Athena.

Wyniki

(a) Melanina i melanosomy w oczach głowonogów i kręgowców

Niespodziewanie, kilka odrębnych warstw tkanki w oczach wszystkich badanych głowonogów wykazuje czarne, specyficzne dla melaniny zabarwienie (ryc. 1). Dane te są poparte analizami AHPO, które potwierdzają, że wybarwione tkanki Loligo, Octopus i Sepia są bogate w eumelaninę i, w mniejszym stopniu, feomelaninę (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S2). Analiza SEM tkanek bogatych w melaninę potwierdza obecność sferoidalnych/podłużnych mikrokosmków (patrz też ; ryc. 1). Jest wysoce nieprawdopodobne, że mikrodrobiny reprezentują bakterie gnilne, ponieważ te pierwsze występują w nienaruszonych oczach świeżo uśmierconych osobników bez śladów uszkodzenia tkanki, wykazują spójne, specyficzne dla wielkości warstwowanie wśród osobników tego samego taksonu i są stabilne w wiązce elektronów. Ponadto jest mało prawdopodobne, aby mikrodrobiny reprezentowały granulki ommochromu, ponieważ te pierwsze występują w warstwach tkanki, które barwią się pozytywnie na melaninę w przekroju histologicznym i zawierają markery diagnostyczne dla eumelaniny w analizach AHPO. Nie są obecne żadne inne mikrobiałka, które mogłyby generować takie wyniki. Mikrodrobiny w warstwach tkanki barwiących się na czarno w przekrojach histologicznych oczu głowonogów są więc najprawdopodobniej interpretowane jako melanosomy.

W głowonogach extant, melanosomy występują w tęczówce i w dodatkowych warstwach tkanki zlokalizowanych w tylnej części oka (określanej tutaj jako RPL) i za tęczówką (określanej tutaj jako warstwa subciliary (SCL); rysunek 1a,c). Wszystkie badane głowonogi posiadają SCL, ale próbki tej tkanki o jakości histologicznej udało się uzyskać tylko u Octopus. Melanosomy różnią się znacząco pod względem geometrii pomiędzy tęczówką a RPL zarówno u Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3) jak i Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (rysunek 2a,c). Różnice w geometrii melanosomów oczu Octopus i Petromyzon są istotne statystycznie dla niektórych, ale nie wszystkich populacji melanosomów (ryc. 2b,d; elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S4). Oprócz melanosomów, siatkówka głowonogów zawiera liczne subangularne, nieregularnie ukształtowane granulki (rysunek 1c). Geometria ta jest niezgodna z geometrią znanych melanosomów u kręgowców i głowonogów; granulki te mogą zatem reprezentować ommatyny lub inne światłoczułe pigmenty, ale ich tożsamość musi być jeszcze wykazana chemicznie. Różne tkanki w oku minoga i bassa barwią się na eu- i feomelaninę (rysunek 1b,c); analiza AHPO potwierdza obecność melaniny w tych tkankach i wykazuje wyraźne różnice w stężeniu eumelaniny pomiędzy oczami tych dwóch kręgowców (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S2).

Rysunek 2. Geometria melanosomów oka. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia i (d) Petromyzon.

Podsumowując, nasze dane ujawniają, że melanosomy w różnych tkankach oka mają znacząco różną geometrię zarówno u extant głowonogów, jak i kręgowców (elektroniczny materiał uzupełniający, tabele S3 i S4; ryc. 2).

(b) Chemia melanosomów oka

Użyliśmy SRS-XRF i XANES, by sprawdzić, czy chemia metali śladowych może odróżnić melanosomy oczu kręgowców od melanosomów oczu głowonogów. W oczach wymarłych kałamarnic i ośmiornic, tylko Cu wykazuje uderzający podział przestrzenny (rysunek 3a,b): jest wzbogacony w twardówce, ale nie w bogatym w melaninę RPL (lub innych tkankach). Zn wykazuje subtelny podział w obu analizowanych taksonach głowonogów: jest nieznacznie wzbogacony w RPL ośmiornicy i, w mniejszym stopniu, w twardówce kałamarnicy. U kręgowców natomiast tkanki zawierające melanosomy wykazują uderzający podział Zn (oraz, u minoga, Fe i Cu) (rysunek 3c,d). U minoga, Fe jest wzbogacone w tęczówce; Zn jest wzbogacony w tęczówce i, szczególnie, naczyniówce i RPE, a Cu jest wzbogacony we wszystkich tkankach noszących melanosomy. U bassa Zn jest wzbogacony we wszystkich tkankach zawierających melanosomy. Na mapach XRF oczu wymarłych kręgowców, naczyniówki i RPE nie można rozróżnić za pomocą chemii pierwiastków śladowych lub ultrastruktury, co zmusza do traktowania ich jako pojedynczej tkanki. Nie uważamy, by miało to wpływ na nasze główne wyniki, ponieważ nasze dane z głowonogów i innych tkanek oczu kręgowców pokazują, że wewnątrzspecyficzne zróżnicowanie chemiczne jest niewielkie w stosunku do zróżnicowania międzyspecyficznego (ryc. 4a,b). Bogate w melanosomy tkanki oczu kręgowców zewnętrznych, ale nie głowonogów, są zatem wzbogacone w Zn (a czasem także Fe i Cu) w stosunku do innych tkanek oka.

Rysunek 3. Analiza SRS-XRF wycinków histologicznych Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) i Dicentrachus (d), oraz kręgowców kopalnych (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) i Knightia (f), kopalnych głowonogów Keuppia (g) i Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Przekroje histologiczne barwione są Warthin-Starry; melanina wydaje się czarna. Mapy SRS-XRF w (a-h) dotyczą regionów pokazanych na przekrojach histologicznych i fotografiach. Patrz elektroniczny materiał uzupełniający, ryc. S2 dla lokalizacji regionów na zdjęciach przekrojów histologicznych i dla lokalizacji regionów na zdjęciach przedstawionych skamieniałości. Czarne strzałki, tęczówka; groty strzałek, RPL; gwiazdka, RPE; białe strzałki, twardówka. Maksymalne wartości stężenia dla każdej mapy SRS-XRF podano w elektronicznym materiale uzupełniającym, tabela S5. (Wersja online w kolorze.)

Figura 4. Chemia pierwiastków śladowych wymarłych i kopalnych głowonogów i kręgowców oraz Tullimonstrum. (a) LDA na podstawie zmierzonych stężeń Ti, Fe, Cu i Zn. (b) Biplot kluczowych pierwiastków przyczyniających się do zmienności w (a). (c) Widma XANES wybranych próbek i wzorców przy krawędzi Cu K (linia przerywana przy 8987 eV). Większe zróżnicowanie chemii pomiędzy Tullimonstrum i innymi skamieniałościami Mazon Creek obecne w (a) w stosunku do zróżnicowania pomiędzy innymi biotami kopalnymi jest obecne nawet po usunięciu Fe ze zbioru danych (elektroniczny materiał uzupełniający, rysunek S4c,d). Groty strzałek w (c) wskazują położenie cech przed krawędziowych w tych widmach. Dane dla kopalnego worka atramentowego kałamarnicy pochodzą z .

Aby sprawdzić, czy sygnał ten utrzymuje się w skamieniałościach, przeanalizowaliśmy gałki oczne w dwóch kopalnych głowonogach i czterech kopalnych kręgowcach. Z wyjątkiem głowonoga Pohlsepia z Mazon Creek, gałki oczne u wszystkich okazów zawierają mikrodrobinki podobne do melanosomów (elektroniczny materiał uzupełniający, ryc. S3). Mapy SRS-XRF pokazują, że gałki oczne u kopalnych kręgowców Knightia i Tetradontiformes indet. (rys. 3e-f) są wzbogacone w Ti i Cu w stosunku do matrycy osadowej, z niewielkim wzbogaceniem Zn w tej ostatniej. Natomiast oczodół Keuppia jest względnie wzbogacony tylko w Ti, Fe i Zn (ryc. 3g). Gałka oczna Tullimonstrum jest wzbogacona w Ti, Fe, Cu i Zn w stosunku do otaczających ją tkanek miękkich (ryc. 3h). Te dane chemiczne nie są w pełni zgodne z sygnałem w badanych kopalnych głowonogach lub kopalnych kręgowcach.

Użyliśmy LDA do zbadania zmienności w stężeniach kluczowych pierwiastków Ti, Fe, Cu i Zn w naszym zestawie danych. Tkanki oka u kręgowców i głowonogów żyjących na wolności rysują się w odrębnych regionach chemospace i oddzielnie od ich kopalnych odpowiedników (ryc. 4a,b). Krytycznie, chemia pierwiastków śladowych w oczodołach jednoznacznych kręgowców z Mazon Creek różni się od obu okazów Tullimonstrum, które plasują się blisko siebie. Oddzielenie jednoznacznych kręgowców z Mazon Creek od Tullimonstrum wzdłuż osi LD2 odzwierciedla wzbogacenie tych pierwszych w Zn i, w mniejszym stopniu, Cu i Fe: co intrygujące, odzwierciedla to zróżnicowanie chemii między wymarłymi kręgowcami i głowonogami. Gałki oczne Tullimonstrum różnią się jednak chemicznie od tych z Pohlsepia, jednoznacznego głowonoga z Mazon Creek.

Badaliśmy zmienność stanu utlenienia Cu, metalu powszechnie związanego z melaniną, u wybranych kopalnych i współczesnych taksonów za pomocą XANES. Widma XANES na krawędzi Cu K pobrane z naczyniówki minoga i dwóch kopalnych kręgowców pokazują piki absorpcyjne skupione przy 8994 ± 1 eV, wskazując na silny udział Cu(II) (rysunek 4c). Widma z RPL kałamarnicy (melanizowane) i twardówki (niemelanizowane) zasadniczo przypominają te z kręgowców, ale wykazują cechy pre-edge odpowiednio przy 8978.59 eV i 8977.58 eV, których położenie wskazuje na obecność Cu(I). W widmie z Keuppia pojawia się cecha pre-edge w zakresie 8976.73-8984.27 eV, również odzwierciedlająca udział Cu(I). Obecność Cu(I) w widmach XANES obecnych i kopalnych głowonogów może odzwierciedlać redukcję Cu(II) podczas analizy. Próbki kręgowców nie wykazują jednak żadnego udziału Cu(I), mimo że były analizowane w identycznych warunkach eksperymentalnych (widma niektórych próbek kręgowców (np. Knightia) wykazują bardzo słabe cechy pre-edge, ale są one mniej łatwe do zinterpretowania jako jednoznaczny dowód na obecność Cu(I)). Alternatywnie, udział Cu(I) w tkankach oczu głowonogów może pochodzić z odtlenionej hemocyjaniny, cząsteczki oddechowej głowonogów. Widmo XANES z Tullimonstrum wykazuje dominujący pik przy 8994.38 eV i znaczącą cechę pre-edge przy 8987.8-8990.2 eV. Te cechy są zgodne z wkładem z wielu stanów utlenienia Cu, w tym wyraźny wkład Cu(I) , jak w przypadku głowonogów ekstantycznych i kopalnych.

Dyskusja

Nasze badania ujawniają, że oczy ekstantnych głowonogów posiadają melanosomy o geometrii specyficznej dla tkanki. Zapadanie się oka głowonoga podczas rozpadu może potencjalnie generować specyficzne dla rozmiaru warstwy melanosomów powierzchownie podobne do tych w RPE kręgowców (ryc. 1a,b). Obecność melanosomów o specyficznych dla tkanki rozmiarach i/lub geometrii w oczach wymarłych głowonogów (ryc. 2a,c) wskazuje zatem, że kolejne warstwy melanosomów o różnych rozmiarach i/lub geometrii w skamieniałościach nie mogą być automatycznie interpretowane jako dowód na istnienie RPE kręgowców. Zakres, do którego inne kopalne grupy bezkręgowców zachowują melanosomy oczu jest nieznany (ale zobacz Lindgren et al. dla chemicznych dowodów na melaninę w oczach kopalnych owadów).

Melanina w oczach kręgowców ekstantnych może wiązać różne elementy, których względna obfitość może się zmieniać w zależności od czynników biologicznych i środowiskowych . U kręgowców, melanina może sekwestrować jony metali, potencjalnie zapobiegając utleniającemu uszkodzeniu tkanek. W porównaniu z kręgowcami, oczy głowonogów wykazują niskie stężenie metali w melanizowanych tkankach (ryc. 3a,b). Prawdopodobnie odzwierciedla to stosunkowo niską obfitość melaniny (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S2) i sugeruje, że szlaki niemelaninowe są odpowiedzialne za zapobieganie uszkodzeniom tkanek spowodowanym ekspozycją na jony metali u głowonogów, tj. funkcja melaniny w oczach głowonogów różni się od tej u kręgowców. Zmienność zawartości melaniny w oczach kręgowców wymarłych (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S2) może potencjalnie odzwierciedlać różnice w ekologii i/lub siedlisku świetlnym.

Nasze dane chemiczne dotyczące kręgowców wymarłych i głowonogów pokazują, że zmienność międzykladowa jest znacznie większa niż w obrębie jednej z grup (rys. 3a-d). Zmelanizowane tkanki oczu wymarłych kręgowców są wzbogacone w Zn (rysunek 4a,b) i wykazują silny sygnał Cu(II) w widmach XANES (rysunek 4c); dla kontrastu, zmelanizowane tkanki wymarłych głowonogów są ubogie w Zn i wykazują mieszany wkład Cu(I) i Cu(II). Podobnie, melanosomy oka u Tullimonstrum mają niską zawartość Zn w porównaniu z melanosomami kręgowców z Mazon Creek, a widma XANES wskazują na obecność Cu(I). Plamy oczne u Pohlsepia nie pokrywają się jednak z Tullimonstrum ani z kręgowcami z Mazon Creek w chemosferze LDA. Chemia jednoznacznych kręgowców i głowonogów z Mazon Creek nie pasuje więc do ogólnego wzorca wzbogacania pierwiastków u współczesnych głowonogów i kręgowców. Łącznie, dane dotyczące morfologii i chemii melanosomów nie są w pełni zgodne z pokrewieństwem kręgowców do Tullimonstrum. Nie można wykluczyć pokrewieństwa z bezkręgowcami, ale pokrewieństwo z głowonogami jest mało prawdopodobne, biorąc pod uwagę brak innych diagnostycznych cech morfologicznych .

Struktura chemiczna melaniny jest znana jako zmieniona przez zmiany pH i ekspozycję na podwyższone stężenia metali, ciśnienia i temperatury, z których wszystkie są powszechnie doświadczane podczas diagenezy. Jest zatem prawdopodobne, że melanosomy w różnych kopalnych taksonów z tego samego lub różnych biota może następować różne ścieżki diagenetyczne, co prowadzi do rozbieżnych chemii pierwiastków śladowych (jak to jest widoczne w badaniach geochemii organicznej kopalnych melanin ). Obserwowane tu zróżnicowanie chemiczne wśród skamieniałości (ryc. 3e-h) prawdopodobnie odzwierciedla zróżnicowanie litologii żywiciela i/lub historii diagenetycznej. Na przykład, brak zachowanych melanosomów w Pohlsepia sugeruje, że okaz ten uległ bardziej rozległej alternacji podczas diagenezy niż inne analizowane okazy kopalne. Ponadto, zróżnicowanie składu chemicznego pierwiastków śladowych wśród skamieniałości z Mazon Creek jest większe niż w przypadku skamieniałości z innych biotopów. Sugeruje to, że chemiczna diageneza melanosomów w skamieniałościach z Mazon Creek jest bardziej zmienna niż w przypadku innych biotopów, co wyklucza rozstrzygającą interpretację pierwotnej chemii pierwiastków śladowych. Niemniej jednak oczy Knightia i okaz Tetradontiformes indet. mają podobne sygnatury metali śladowych, mimo że pochodzą z różnych biotopów, a więc przypuszczalnie mają różne historie diagenetyczne. Przyszłe badania ukierunkowane na odpowiedź chemii pierwiastków śladowych melanosomów na różne czynniki diagenetyczne, np. pH, litologię, ciśnienie i temperaturę, będą krytyczne dla dyskryminacji oryginalnej chemii od chemicznych produktów diagenezy.

Dostępność danych

Dostarczamy wszystkie dane w tekście głównym, elektronicznych materiałach uzupełniających lub poprzez Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Wkład autorów

C.S.R. i T.I.A. wykonali histologię; C.S.R., T.I.A. i M.E.M. wykonali SEM; C.S.R., M.E.M. i S.M.W. wykonali szybkie skanowanie synchrotronowe – fluorescencję rentgenowską i rentgenowską spektroskopię absorpcyjną (XAS); S.I. i K.W. wykonali analizy AHPO; C.S.R. i M.E.M. napisali manuskrypt z udziałem wszystkich pozostałych autorów.

Interesy konkurencyjne

Autorzy nie zgłaszają interesów konkurencyjnych.

Funding

Supported by European Research Starting Grant (grant nr ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) awarded to M.E.M. The use of the Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, is supported by the US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences under contract no. DE-AC02-76SF00515.

Podziękowania

Dziękujemy A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson i A. Stroup za dostęp do okazów; N. Edwards za wsparcie XAS; V. Rossi i R. Wogelius za dyskusję.

Footnotes

Elektroniczne materiały uzupełniające są dostępne online pod adresem https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. All rights reserved.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015How complexity originates: the evolution of animal eyes. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016The eyes of Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, Carboniferous) reveal a vertebrate affinity. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Comparisons of the structural and chemical properties of melanosomes isolated from retinal pigment epithelium, iris and choroid of newborn and mature bovine eyes. Photochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012Intraocular distribution of melanin in human, monkey, rabbit, minipig and dog eyes. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optical coherence tomography of light-driven melanosome translocation in retinal pigment epithelium. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000Ewolucja oczu. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogenesis in the ink gland of Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fine structure of melanogenesis in the ink sac of Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolysis reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002The usefulness of 4-amino-3-hydroxyphenylalanine as a specific marker for pheomelanin. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissue-specific geometry and chemistry of modern and fossilized melanosomes reveal internal anatomy of extinct vertebrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analyse histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: pakiet oprogramowania do statystyki paleontologicznej do edukacji i analizy danych. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011The microanalysis toolkit: Oprogramowanie do przetwarzania obrazów fluorescencji rentgenowskiej. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S0909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Immunoelectron-microscopic study of G-protein distribution on photoreceptor cells of the cephalopod Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987X-ray absorption edge determination of the oxidation state and coordination number of copper: application to the type 3 site in Rhus vernicifera Laccase and its reaction with oxygen. J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse immune functions of hemocyanins. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al.. 2019Fossil insect eyes shed light on trilobite optics and the arthropod pigment screen. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Physical and chemical characterization of iris and choroid melanosomes isolated from newborn and mature cows. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017The 'Tully Monster’ is not a vertebrate: characters, convergence and taphonomy in Palaeozoic problematic animals. Palaeontology 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. In Mazon creek fossils (ed. Nitecki MH), pp. 269-301. New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. In The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitive soft-bodied cephalopods from the Cambrian. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorpcja Pb(II) i Cd(II) przez melaninę kałamarnicy Ommastrephes bartrami. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically altered melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Data from: Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopods: implications for the affinity of Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar

.