Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopods: implicaties voor de affiniteit van Tullimonstrum

Introductie

Screening pigmenten zijn een essentieel onderdeel van visuele systemen in dieren, omdat ze dwalend licht absorberen, waardoor gerichte fotoreceptie en de bescherming van fotoreceptoren tegen ultraviolette straling . Tot de afschermende pigmenten van ongewervelde dieren behoren ommochromen, pterines en, minder vaak, melanine. Het voornaamste screeningpigment bij gewervelde dieren is melanine, dat voorkomt in de vorm van melanosomen (membraangebonden organellen) in de iris, het vaatvlies, het retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) en de sclera (figuur 1). RPE melanosomen omvatten bolvormige en langwerpige vormen die ruimtelijk verdeeld zijn. Bij fel invallend licht migreren langwerpige melanosomen naar de apicale uitsteeksels van RPE-cellen, en beschermen zo de lichtgevoelige pigmenten in fotoreceptorcellen tegen verbleking. Intrigerend is dat de ogen van het raadselachtige taxon Tullimonstrum gregarium (Carboon, Mazon Creek, IL, USA) ook opeenvolgende lagen melanosomen van verschillende geometrie vertonen. Dit kenmerk werd geïnterpreteerd als bewijs van verwantschap met vertebraten op basis van een overzicht van de verspreiding en morfologie van melanosomen bij overblijvende dieren. Of melanosomen in ongewervelde ogen georganiseerd zijn in opeenvolgende weefsellagen zoals in vertebraten is echter onbekend. Om dit op te lossen is systematisch onderzoek nodig van de screeningpigmenten in ongewervelde ogen. Koppotigen zijn een ideale test case omdat zij, net als vertebraten, een complex camera-achtig oog bezitten met meerdere gepigmenteerde weefsellagen en waarvan bekend is dat zij melanosomen produceren (in de inktzak ). Wij hebben systematisch de anatomische plaats en de chemie van gepigmenteerde weefsels, en de geometrie van pigmentkorrels, gekarakteriseerd in de ogen van de gewone octopus (Octopus vulgaris), de Europese pijlinktvis (Loligo vulgaris), de gewone zeekat (Sepia officianalis), de zeeprik (Petromyzon marinus) en de Europese zeebaars (Dicentrachus labrax), in combinatie met gegevens uit fossielen (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S1). De weefsels werden geanalyseerd met behulp van Warthin-Starry histologische kleuring, alkalische waterstofperoxide oxidatie (AHPO ) en scanning elektronenmicroscopie (SEM). In de ogen van gewervelde dieren vermindert melanine oxidatieve stress door metaalionen te cheleren en recent werk toont aan dat melanosomen van gewervelde dieren een weefselspecifieke sporenelementchemie hebben. Daarom hebben we getest of de chemie van sporenelementen melanosomen van vertebraten en cephalopoden kan onderscheiden met behulp van synchrotron rapid scanning-X-ray fluorescentie (SRS-XRF) en X-ray absorption near edge structure (XANES) spectroscopie.

Figuur 1. Anatomie van de ogen van bestaande koppotigen en gewervelden. Schematische afbeeldingen van (a) het oog van koppotigen en (b) het oog van vertebraten met, inzet, details van weefsellagen. (c) Histologische coupes en scanning electron micrographs (SEM) van ogen bij Loligo, Octopus, Sepia en Petromyzon. De coupes zijn gekleurd met Warthin-Starry; melanine is zwart. Alle weefsels vertonen melanosoomachtige microlichaampjes. C, vaatvlies; I/zwarte pijlen, iris; L, lens; O, oogzenuw; OG, ganglia van de oogzenuw; R, netvlies; RPE/*, retinaal pigmentepitheel; RPL/pijlpunten, retinaal gepigmenteerde laag; S/witte pijl, sclera; SCL, subciliaire laag; V, glasvocht. (Online versie in kleur.)

Materiaal en methoden

(a) Moderne en fossiele specimens

Specimens van Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon en Dicentrachus (elk n = 5) werden verkregen van commerciële leveranciers (Ballycotton Seafoods en K O’Connell Fish Merchants (English Market in Cork, Republiek Ierland) en Online Baits UK). De lampreien werden bevroren geleverd en onmiddellijk na het ontdooien ontleed; de koppotigen en de Europese zeebaars waren bij aankoop overleden en werden binnen 24 uur na overlijden ontleed. Ogen werden gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gedehydrateerd in ethanol en opgeslagen in 70% ethanol voorafgaand aan verdere analyse.

Deze studie omvat de analyse van de oogvlekken van de volgende acht fossielen: uit Mazon Creek, twee specimens van Tullimonstrum (CKGM F 6426 en FMNH PE 22061), één specimen elk van de gewervelde dieren Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) en Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) en het enige specimen van de fossiele koppotige Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); uit Green River (Eoceen, Colorado/Utah/Wyoming), één specimen van Knightia sp. (FOBU 17591) en uit de Fur Formation (Eoceen, Denemarken) een onbepaalde Teterodontiformes (NHMD 199838); uit de Hâkel en Hâdjoula Lagerstätte (Laat-Krijt, Libanon), de fossiele octopus Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Institutionele afkortingen: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Natural History Museum of Denmark; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Alkalische hydroxide-peroxide-oxidatie en hydrolyse met hydrojoodzuur

Weefsels werden met steriele instrumenten ontleed, in glazen flesjes gedaan, gevriesdroogd en in poedervorm gebracht. Het vaatvlies en de RPE van vertebraten konden niet worden gescheiden en werden daarom in deze analyse als één weefsel behandeld. Gevriesdroogde weefselmonsters (9-17 mg) werden in water gehomogeniseerd met een Ten-Broeck-homogenisator tot een concentratie van 10 mg ml-1 en aliquots van 100 µl of 200 µl werden verwerkt met AHPO en hydrolyse met hydrojoodzuur. AHPO na hydrolyse met HCl test op de aanwezigheid van pyrrol-2,3,5-tricarbonzuur (een marker voor eumelanine ); hydrojoodzuur analyse test op de aanwezigheid van 4-amino-3-hydroxylfenylalanine (een marker voor phaeomelanine ).

(c) Histologie

Gesneden weefselmonsters van de ogen van koppotigen en van het vaatvlies, de iris, het RPE en de sclera van de ogen van gewervelde dieren werden gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De gefixeerde weefselmonsters werden verwerkt voor histologie en gekleurd met het Warthin-Starry-protocol, dat de aanwezigheid van melanine aantoont.

(d) Rasterelektronenmicroscopie

Kleine monsters (ongeveer 1-2 mm2) van het oogweefsel werden gedroogd met hexamethyldisilazaan of vloeibare stikstof. Gedroogde weefselmonsters en uncoverslipped dunne secties werden gemonteerd op aluminium stubs, sputter-gecoat met goud / palladium en belicht bij een versnellende spanning van 5-15 keV met behulp van een FEI Quanta 650 SEM en een Zeiss Gemini Supra 40 SEM. Energie dispersieve X-ray spectroscopie (EDS) analyses werden uitgevoerd met behulp van een Hitachi S-3500N VP-SEM uitgerust met een EDAX Genesis energie dispersieve spectrometer bij een versnellende spanning van 15 kV met acquisitietijden van 120 s voor EDS kaarten (elektronisch aanvullend materiaal, figuur S1).

(e) Analyse van melanosoom geometrie en grootte

Geometrie gegevens werden gemeten voor ten minste 20 melanosomen (en, indien van toepassing, melanosoom-achtige microlichaampjes) voor elk weefsel in elk specimen. Verschillen in geometrie werden getest met ANOVA of (wanneer de gegevens heteroscedastisch zijn) Welch’s F-test gekoppeld aan paarsgewijze post hoc analyse in PAST (Tukey voor ANOVA en Dunn voor Welch’s F-test analyses, respectievelijk). Melanosoom geometrie gegevens voor S. officianalis zijn homoscedastisch, maar niet-normaal en werden dus geanalyseerd post-log-transformation.

(f) Synchrotron rapid-scanning X-ray fluorescentie

Metingen werden uitgevoerd op bundellijnen 2-3 en 10-2 bij de Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). De invallende röntgenenergie werd ingesteld op 11 keV met behulp van een Si (111) dubbelkristal monochromator met de opslagring met 500 mA in top-off mode bij 3,0 GeV. Bij bundellijn 2-3 werd een microgerichte bundel van 2 × 2 µm geleverd door een Rh-gecoat Kirkpatrick-Baez-spiegelpaar, terwijl bundellijn 10-2 wolfraam-openingen gebruikte om selecteerbare bundelgroottes tussen 25 en 200 µm te bereiken. De intensiteit van de invallende röntgenstralen werd bij elke beamline gemeten met een met stikstof gevulde ionisatiekamer. Monsters werden gemonteerd onder een hoek van 45° ten opzichte van de invallende röntgenbundel en werden ruimtelijk gerasterd gedurende 20-50 ms pixel-1 verblijftijd. Bij bundellijn 2-3 werden de volgende monsters in kaart gebracht: niet-afgeschraapte en niet-gekleurde dunne coupes van de ogen van één individu van Dicentrachus en Octopus en van twee individuen van Loligo en Petromyzon; de oogvlekken van één specimen van Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. en de Teterodontiformes indet. Op bundellijn 10-2 werden gekarteerd: het tweede exemplaar van Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia en monsters van zachte weefsels van Keuppia sp. De twee verschillende bundellijnen werden gebruikt om monsters/specimens van verschillende afmetingen onder te brengen (specimens die te groot waren voor de monsterfase op bundellijn 2-3 werden ondergebracht op 10-2). De fossiele gegevens van elke bundellijn werden gekalibreerd aan de hand van dezelfde reeks standaarden; variaties in de gegevens zijn dus reëel en weerspiegelen geen variaties in de analytische parameters. Het volledige fluorescentiespectrum werd op elk gegevenspunt verzameld en de intensiteit van fluorescentielijnen voor geselecteerde elementen (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu en Zn) werd gecontroleerd met behulp van een silicium drift Vortex detector (Hitachi, USA) gekoppeld aan een Xpsress3 pulsverwerkingssysteem (Quantum Detectors) voor energie-discriminatie. Fluorescentie-intensiteiten werden gecorrigeerd voor de dode tijd van de detector en genormaliseerd tegen de inkomende flux (I0STRM). De concentraties van elk element in µg cm-2 werden gekalibreerd met behulp van NIST traceerbare dunne film elementaire standaarden. De gegevens werden verwerkt met behulp van de MicroAnalysis Toolkit-software. Het gemiddelde en de standaardafwijking werden berekend voor de concentraties van elk element in geselecteerde gebieden van belang. Verschillen in elementaire concentraties tussen regio’s van belang werden beoordeeld met behulp van lineaire discriminantanalyse (LDA) in PAST . De gegevens werden gegroepeerd op één classificatieniveau dat overeenkomt met het weefsel van oorsprong, b.v. Octopus retinal pigmented layer (RPL), Petromyzon iris, Petromyzon sclera, FMNH PE 22061 eyespot, enz. Principale componenten analyse van de gegevens levert een verdeling van de gegevens op die vrijwel identiek is aan LDA (elektronisch aanvullend materiaal, figuur S4a,b).

(g) Röntgenabsorptie nabij randstructuur spectroscopie

XANES spectra werden verzameld op beamline 2-3 van het SSRL vanaf interessante punten die in de XRF kaarten waren geïdentificeerd. Dit werd bereikt door de energie van de invallende bundel stapsgewijs door de Cu K-rand te sturen en de uitgezonden intensiteit van de Kα-lijn als functie van de invallende energie te registreren. Kalibratie van de monochromator-energie werd bereikt met behulp van een Cu-folie. XANES-spectra werden verkregen van de RPL en de sclera van Loligo, het vaatvlies van Petromyzon en van oogvlekken in het specimen van Tetradontiformes indet., Knightia en Tullimonstrum (CKGM F 6426). De spectra werden verwerkt met behulp van het softwarepakket Athena.

Resultaten

(a) Melanine en melanosomen in de ogen van bestaande koppotigen en gewervelden

Onverwacht is dat verscheidene afzonderlijke weefsellagen in de ogen van alle onderzochte koppotigen een zwarte, melanine-specifieke kleuring vertonen (figuur 1). Deze gegevens worden ondersteund door AHPO-analyses, die bevestigen dat de gekleurde weefsels van Loligo, Octopus en Sepia rijk zijn aan eumelanine en, in mindere mate, phaeomelanine (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S2). SEM-analyse van de melaninerijke weefsels bevestigt de aanwezigheid van sferoïdale/obolische microlichaampjes (zie ook ; figuur 1). Het is hoogst onwaarschijnlijk dat de microlichaampjes bederfveroorzakende bacteriën vertegenwoordigen, aangezien ze voorkomen in de intacte ogen van pas gedode specimens zonder tekenen van weefselbeschadiging, consistente groottespecifieke gelaagdheid vertonen bij specimens van hetzelfde taxon en stabiel zijn onder de elektronenbundel. Voorts is het onwaarschijnlijk dat de microlichaampjes ommochroomkorrels vertegenwoordigen, aangezien de eerstgenoemde voorkomen in weefsellagen die in histologische coupes positief kleuren voor melanine en in AHPO-analyses diagnostische merkers voor eumelanine bevatten. Er zijn geen andere microlichaampjes aanwezig die deze resultaten zouden kunnen opleveren. De microlichaampjes in de weefsellagen die zwart kleuren in histologische coupes van de ogen van koppotigen zijn dus het meest plausibel geïnterpreteerd als melanosomen.

Bij bestaande koppotigen komen melanosomen voor in de iris en in extra weefsellagen aan de achterkant van het oog (hier gedefinieerd als de RPL) en achter de iris (hier gedefinieerd als de subciliaire laag (SCL); figuur 1a,c). Alle onderzochte koppotigen bezitten een SCL, maar alleen van Octopus konden monsters van histologische kwaliteit van dit weefsel worden verkregen. Melanosomen verschillen significant in geometrie tussen de iris en de RPL bij zowel Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3) als Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (figuur 2a,c). Verschillen in de geometrie van oogmelanosomen van Octopus en Petromyzon zijn statistisch significant voor sommige, maar niet alle, melanosomenpopulaties (figuur 2b,d; elektronisch aanvullend materiaal, tabel S4). Naast melanosomen bevat het netvlies van koppotigen overvloedig subangular, onregelmatig gevormde korrels (figuur 1c). Deze geometrie is inconsistent met die van bekende melanosomen bij gewervelde dieren en koppotigen; de korrels kunnen dus ommatines of andere lichtgevoelige pigmenten vertegenwoordigen, maar hun identiteit moet nog chemisch worden aangetoond. Verschillende weefsels in het oog van de lamprei en de zeebaars zijn gekleurd voor eumelanine en feomelanine (figuur 1b,c); AHPO-analyse bevestigt de aanwezigheid van melanine in deze weefsels en toont een duidelijke variatie aan in eumelanineconcentraties tussen de ogen van de twee gewervelde dieren (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S2).

Figuur 2. Geometrie van oogmelanosomen. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia en (d) Petromyzon.

Samenvattend blijkt uit onze gegevens dat melanosomen in verschillende oogweefsels significant verschillende geometrieën hebben bij zowel extante koppotigen als vertebraten (elektronisch aanvullend materiaal, tabellen S3 en S4; figuur 2).

(b) Chemie van oogmelanosomen

We gebruikten SRS-XRF en XANES om te testen of de chemie van sporenmetalen gewervelde van koppotigen oogmelanosomen kan onderscheiden. In de ogen van de overlevende inktvis en octopus, vertoont alleen Cu een opvallende ruimtelijke verdeling (figuur 3a,b): het is verrijkt in de sclera maar niet in de melaninerijke RPL (of andere weefsels). Zn vertoont een subtiele verdeling in beide geanalyseerde koppotigen: het is licht verrijkt in de RPL van de octopus en, in mindere mate, in de sclera van de pijlinktvis. Bij de gewervelde dieren echter vertonen de melanosoom-houdende weefsels een opvallende verdeling van Zn (en, bij de lamprei, Fe en Cu) (figuur 3c,d). Bij de lamprei is Fe verrijkt in de iris; Zn is verrijkt in de iris en vooral in het choroïd en de RPE, en Cu is verrijkt in alle melanosoom-dragende weefsels. Bij de baars is Zn verrijkt in alle melanosoom-dragende weefsels. In XRF-kaarten van ogen van gewervelde dieren kunnen het vaatvlies en de RPE niet worden onderscheiden aan de hand van chemische of ultrastructurele sporenelementen, zodat ze als één enkel weefsel moeten worden behandeld. Wij menen dat dit geen invloed heeft op onze voornaamste resultaten, aangezien onze gegevens van koppotigen en andere gewervelde oogweefsels aantonen dat de intra-specifieke chemische variatie gering is in vergelijking met de interspecifieke variatie (figuur 4a,b). Melanosoomrijke weefsels in de ogen van gewervelde dieren, maar niet in die van koppotigen, zijn dus verrijkt in Zn (en soms Fe en Cu) in vergelijking met andere oogweefsels.

Figuur 3. SRS-XRF-analyse van histologische coupes van Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) en Dicentrachus (d), en van fossiele gewervelde dieren (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) en Knightia (f), fossiele koppotigen Keuppia (g) en Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Histologische coupes zijn gekleurd met Warthin-Starry; melanine is zwart. De SRS-XRF-kaarten in (a-h) zijn van gebieden die op histologische coupes en foto’s te zien zijn. Zie het elektronisch aanvullend materiaal, figuur S2 voor locaties van regio’s in foto’s van histologische coupes en voor locaties van regio’s in foto’s van getoonde fossielen. Zwarte pijlen, iris; pijlpunten, RPL; asterisk, RPE; witte pijlen, sclera. De maximale concentratiewaarden voor elke SRS-XRF-kaart zijn te vinden in het elektronisch aanvullend materiaal, tabel S5. (Online versie in kleur.)

Figuur 4. Chemie van de sporenelementen van levende en fossiele koppotigen en gewervelde dieren en Tullimonstrum. (a) LDA op basis van gemeten concentraties van Ti, Fe, Cu en Zn. (b) Biplot van de belangrijkste elementen die bijdragen tot de variatie in (a). (c) XANES-spectra van geselecteerde specimens en standaarden aan de rand van Cu K (stippellijn bij 8987 eV). De grotere variatie in chemie tussen Tullimonstrum en andere Mazon Creek fossielen in (a) in vergelijking met de variatie tussen andere fossiele biota’s is zelfs aanwezig wanneer Fe uit de dataset wordt verwijderd (elektronisch aanvullend materiaal, figuur S4c,d). Pijlpunten in (c) geven de positie van pre-edge kenmerken in deze spectra. De gegevens voor fossiele inktzakken van inktvissen zijn afkomstig van .

Om te testen of dit signaal in fossielen blijft bestaan, hebben we oogvlekken geanalyseerd in twee fossiele koppotigen en vier fossiele gewervelde dieren. Met uitzondering van de Mazon Creek koppotige Pohlsepia, bevatten de oogvlekken in alle specimens melanosoom-achtige microlichamen (elektronisch aanvullend materiaal, figuur S3). SRS-XRF-kaarten tonen aan dat oogvlekken in de fossiele gewervelde dieren Knightia en Tetradontiformes indet. (figuur 3e-f) verrijkt zijn in Ti en Cu ten opzichte van de sedimentaire matrix, met een geringe verrijking van Zn in de laatste. Daarentegen is de oogpot van Keuppia relatief verrijkt in Ti, Fe en Zn alleen (figuur 3g). De oogpot van Tullimonstrum is verrijkt in Ti, Fe, Cu en Zn ten opzichte van de omringende zachte weefsels (figuur 3h). Deze chemische gegevens zijn niet volledig consistent met het signaal in de bestudeerde fossiele koppotigen of fossiele gewervelde dieren.

We gebruikten LDA om de variatie in concentraties van de sleutelelementen Ti, Fe, Cu en Zn in onze dataset te onderzoeken. Oogweefsels van gewervelde dieren en koppotigen plotten in afzonderlijke regio’s van de chemospace en afzonderlijk van hun fossiele tegenhangers (figuur 4a,b). Van cruciaal belang is dat de chemische samenstelling van de sporenelementen van de oogvlekken van ondubbelzinnige gewervelde dieren uit de Mazon Creek verschilt van die van beide exemplaren van Tullimonstrum, die dicht bij elkaar liggen. De scheiding van ondubbelzinnige gewervelde dieren uit Mazon Creek van Tullimonstrum langs de LD2-as weerspiegelt de verrijking van eerstgenoemde in Zn en, in mindere mate, Cu en Fe: intrigerend genoeg weerspiegelt dit de variatie in chemie tussen overblijvende gewervelde dieren en koppotigen. De oogvlekken van Tullimonstrum zijn echter chemisch verschillend van die van Pohlsepia, een ondubbelzinnige koppotige uit de Mazon Creek.

We onderzochten variatie in de oxidatietoestand van Cu, een metaal dat gewoonlijk wordt geassocieerd met melanine , in geselecteerde fossiele en moderne taxa met behulp van XANES. XANES spectra aan de Cu K rand genomen van het vaatvlies van de lamprei en van twee fossiele gewervelde oogvlekken vertonen alle absorptiepieken gecentreerd bij 8994 ± 1 eV, wat wijst op sterke bijdragen van Cu(II) (figuur 4c). Spectra van de inktvis RPL (gemelaniseerd) en sclera (niet gemelaniseerd) lijken in grote lijnen op die van de gewervelde dieren, maar vertonen pre-edge kenmerken bij 8978.59 eV en 8977.58 eV, respectievelijk, waarvan de posities de aanwezigheid van Cu(I) onthullen. In het spectrum van Keuppia verschijnt een pre-edge bij 8976,73-8984,27 eV, die ook op een Cu(I)-bijdrage wijst. De aanwezigheid van Cu(I) in XANES spectra van bestaande en fossiele oogpotten van koppotigen zou reductie van Cu(II) tijdens de analyse kunnen weerspiegelen. De gewervelde monsters vertonen echter geen bijdrage van Cu(I), ondanks het feit dat ze onder identieke experimentele omstandigheden zijn geanalyseerd (spectra van sommige gewervelde monsters (b.v. Knightia) vertonen zeer zwakke pre-edge kenmerken, maar deze zijn minder gemakkelijk te interpreteren als ondubbelzinnig bewijs voor Cu(I)). Een andere mogelijkheid is dat Cu(I)-bijdragen in de oogweefsels van koppotigen afkomstig zijn van zuurstofarme hemocyanine, de ademhalingsmolecule van de koppotigen. Het XANES-spectrum van Tullimonstrum vertoont een dominante piek bij 8994,38 eV en een prominent pre-edge kenmerk bij 8987,8-8990,2 eV. Deze kenmerken zijn consistent met bijdragen van meerdere Cu-oxidatietoestanden, waaronder een duidelijke Cu(I)-bijdrage, zoals bij de bestaande en fossiele koppotigen.

Discussie

Onze studie toont aan dat de ogen van bestaande koppotigen melanosomen bezitten met weefselspecifieke geometrieën. De ineenstorting van het oog van koppotigen tijdens het vergaan zou mogelijk grootte-specifieke lagen melanosomen kunnen genereren die oppervlakkig vergelijkbaar zijn met die in de gewervelde RPE (figuur 1a,b). De aanwezigheid van melanosomen met weefselspecifieke afmetingen en/of geometrieën in de ogen van extraverte koppotigen (figuur 2a,c) geeft daarom aan dat opeenvolgende lagen melanosomen van verschillende afmetingen en/of geometrieën in fossielen niet automatisch kunnen worden geïnterpreteerd als bewijs voor de vertebrate RPE. De mate waarin andere fossiele ongewervelde groepen oogmelanosomen bewaren is onbekend (maar zie Lindgren et al. voor chemisch bewijs voor melanine in de ogen van fossiele insecten).

Melanine in de ogen van overblijvende gewervelde dieren kan verschillende elementen binden, waarvan de relatieve overvloed kan variëren met biologische en omgevingsfactoren . Bij gewervelde dieren kan melanine metaalionen sekwestreren, waardoor mogelijk oxidatieve weefselschade wordt voorkomen. Vergeleken met gewervelde dieren vertonen de ogen van koppotigen lage concentraties metalen in gemelaniseerde weefsels (figuur 3a,b). Dit weerspiegelt waarschijnlijk de relatief lage overvloed aan melanine (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S2) en suggereert dat niet-melanine pathways verantwoordelijk zijn voor het voorkomen van weefselschade door blootstelling aan metaalionen bij koppotigen, d.w.z. dat de functie van melanine in koppotigen ogen verschilt van die in gewervelde dieren. De variatie in het melaninegehalte in de ogen van vertebraten (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S2) zou een weerspiegeling kunnen zijn van variaties in ecologie en/of lichthabitat.

Uw chemische gegevens over vertebraten en koppotigen tonen aan dat de variatie tussen de groepen duidelijk groter is dan die binnen één van beide groepen (figuur 3a-d). De gemelaniseerde weefsels in de ogen van gewervelde dieren zijn verrijkt in Zn (figuur 4a,b) en vertonen een sterk Cu(II) signaal in XANES spectra (figuur 4c); daarentegen zijn gemelaniseerde weefsels in koppotigen laag in Zn en vertonen een gemengde bijdrage van Cu(I) en Cu(II). Evenzo zijn de oogmelanosomen in Tullimonstrum laag in Zn vergeleken met die in gewervelde dieren uit Mazon Creek en wijzen XANES spectra op de aanwezigheid van Cu(I). De oogvlekken van Pohlsepia komen echter niet overeen met die van Tullimonstrum of met die van de gewervelde dieren van Mazon Creek in LDA-chemospace. De chemie van de ondubbelzinnige gewervelde en koppotigen in de Mazon Creek past dus niet in het algemene patroon van elementverrijking in moderne koppotigen en gewervelde dieren. Al met al zijn de gegevens over de morfologie en chemie van de melanosomen niet volledig consistent met een affiniteit van gewervelde dieren voor Tullimonstrum. Een affiniteit met ongewervelden kan niet worden uitgesloten, maar een affiniteit met koppotigen is ongeloofwaardig, gezien de afwezigheid van andere morfologische kenmerken.

Het is bekend dat de chemische structuur van melanine verandert door veranderingen in pH en blootstelling aan verhoogde metaalconcentraties, druk en temperaturen, die allemaal voorkomen tijdens de diagenese. Het is daarom waarschijnlijk dat melanosomen in verschillende fossiele taxa van dezelfde of verschillende biota verschillende diagenetische paden kunnen volgen, wat resulteert in verschillende spoorelementchemie (zoals blijkt uit studies van de organische geochemie van fossiele melaninen). De hier waargenomen chemische variatie tussen fossielen (figuur 3e-h) weerspiegelt vermoedelijk variatie in de lithologie van de gastheer en/of de diagenetische geschiedenis. Zo suggereert de afwezigheid van bewaard gebleven melanosomen in Pohlsepia dat dit specimen tijdens de diagenese een uitgebreidere verandering heeft ondergaan dan de andere geanalyseerde fossiele specimens. Verder is de variatie in spoorelementchemie tussen de fossielen uit Mazon Creek groter dan voor fossielen uit alle andere biotas. Dit suggereert dat de chemische diagenese van melanosomen in fossielen uit Mazon Creek variabeler is dan die voor andere biota’s, waardoor een sluitende interpretatie van de oorspronkelijke chemische samenstelling van de sporenelementen onmogelijk is. Desondanks hebben de ogen van Knightia en het specimen van Tetradontiformes indet. vergelijkbare sporenmetaalsignaturen, ondanks het feit dat ze uit verschillende biota’s komen en dus vermoedelijk verschillende diagenetische geschiedenissen hebben. Toekomstige studies die zich richten op de reactie van melanosoom sporenelement chemie op verschillende diagenetische factoren, zoals pH, lithologie, druk en temperatuur, zal van cruciaal belang zijn voor het onderscheid tussen de oorspronkelijke chemie en chemische producten van diagenese.

Toegankelijkheid van gegevens

Wij bieden alle gegevens in de hoofdtekst, elektronisch aanvullend materiaal of via de Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Bijdragen van de auteurs

C.S.R. en T.I.A. verrichtten histologie; C.S.R., T.I.A. en M.E.M. verrichtten SEM; C.S.R., M.E.M. en S.M.W. voerden synchrotron rapid scanning-X-ray fluorescentie en X-ray absorptie spectroscopie (XAS) uit; S.I. en K.W. voerden AHPO analyses uit; C.S.R. en M.E.M. schreven het manuscript met input van alle andere auteurs.

Competing interests

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Funding

Gesteund door European Research Starting Grant (grant no. ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) toegekend aan M.E.M. Het gebruik van de Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, wordt gesteund door het US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences onder contract no. DE-AC02-76SF00515.

Acknowledgements

Wij danken A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson en A. Stroup voor toegang tot preparaten; N. Edwards voor XAS-ondersteuning; V. Rossi en R. Wogelius voor discussie.

Footnotes

Elektronisch aanvullend materiaal is online beschikbaar op https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. All rights reserved.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015Hoe complexiteit ontstaat: de evolutie van dierlijke ogen. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016De ogen van Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, Carboon) onthullen een gewervelde verwantschap. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Comparisons of the structural and chemical properties of melanosomes isolated from retinal pigment epithelium, iris and choroid of newborn and mature bovine eyes. Fotochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012Intraocular distributie van melanine in menselijke, aap, konijn, minipig en hond ogen. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optische coherentie tomografie van licht-gedreven melanosoom translocatie in retinaal pigment epitheel. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000Evolutie van de ogen. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogenesis in the ink gland of Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fijne structuur van melanogenese in de inktzak van Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolyse reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002The usefulness of 4-amino-3-hydroxyphenylalanine as a specific marker for pheomelanin. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissue-specific geometry and chemistry of modern and fossilized melanosomes reveal internal anatomy of extinct vertebrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analyse histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: paleontologisch statistisch softwarepakket voor onderwijs en gegevensanalyse. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011De toolkit voor microanalyse: Software voor het verwerken van röntgenfluorescentiebeelden. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Wetenschap 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: data-analyse voor röntgenabsorptiespectroscopie met behulp van IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S0909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Immunoelectron-microscopic study of G-protein distribution on photoreceptor cells of the cephalopod Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987X-ray absorption edge determination of the oxidation state and coordination number of copper: application to the type 3 site in Rhus vernicifera Laccase and its reaction with oxygen. J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse immuunfuncties van hemocyanines. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al. 2019Fossiele insectenogen werpen licht op de optiek van trilobieten en het pigmentscherm van geleedpotigen. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Physical and chemical characterization of iris and choroid melanosomes isolated from newborn and mature cows. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017Het ‘Tully Monster’ is geen gewerveld dier: karakters, convergentie en taphonomie bij paleozoïsche problematische dieren. Paleontologie 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. In Mazon creek fossils (ed. Nitecki MH), pp. 269-301. New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. In The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitieve zachtgerande koppotigen uit het Cambrium. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorptie van Pb(II) en Cd(II) door melanine van de pijlinktvis Ommastrephes bartrami. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically altered melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Data from: Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopods: implications for the affinity of Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar