Spettroscopia di assorbimento a raggi X di sincrotrone di melanosomi in vertebrati e cefalopodi: implicazioni per l’affinità di Tullimonstrum

Introduzione

I pigmenti schermanti sono una componente essenziale dei sistemi visivi negli animali in quanto assorbono la luce errante, permettendo così la fotorecezione direzionale e la protezione dei fotorecettori dalla radiazione ultravioletta. I pigmenti schermanti degli invertebrati includono omocromi, pterine e, meno frequentemente, melanina. Al contrario, il pigmento primario di screening nei vertebrati è la melanina, che si verifica come melanosomi (organelli legati alla membrana) nell’iride, coroide, epitelio retinico pigmentato (RPE) e sclera (figura 1). I melanosomi RPE includono forme sferiche e allungate che sono suddivise spazialmente. In caso di luce incidente intensa, i melanosomi allungati migrano verso i processi apicali delle cellule RPE, proteggendo così i pigmenti fotosensibili delle cellule fotorecettrici dallo sbiancamento. Intrigante, gli occhi dell’enigmatico taxon Tullimonstrum gregarium (Carbonifero, Mazon Creek, IL, USA) mostrano anche strati successivi di melanosomi di geometrie diverse. Questa caratteristica è stata interpretata come prova di un’affinità con i vertebrati sulla base di una revisione della distribuzione e della morfologia dei melanosomi negli animali esistenti. Se i melanosomi degli occhi degli invertebrati sono organizzati in strati successivi di tessuto come nei vertebrati è, tuttavia, sconosciuto. Risolvere questo richiede un’indagine sistematica dei pigmenti di screening negli occhi degli invertebrati. I cefalopodi sono un banco di prova ideale perché, come i vertebrati, possiedono un occhio complesso con più strati di tessuto pigmentato e sono noti per produrre melanosomi (nel sacco dell’inchiostro). Abbiamo caratterizzato sistematicamente la posizione anatomica e la chimica dei tessuti pigmentati, e la geometria dei granuli di pigmento, negli occhi del polpo comune (Octopus vulgaris), calamaro europeo (Loligo vulgaris), seppia comune (Sepia officianalis), lampreda di mare (Petromyzon marinus) e branzino europeo (Dicentrachus labrax), insieme ai dati dai fossili (materiale supplementare elettronico, tabella S1). I tessuti sono stati analizzati utilizzando la colorazione istologica Warthin-Starry, l’ossidazione con perossido di idrogeno alcalino (AHPO ) e la microscopia elettronica a scansione (SEM). Negli occhi dei vertebrati estanti, la melanina riduce lo stress ossidativo chelando ioni metallici e il lavoro recente mostra che melanosomi vertebrati hanno tessuto-specifiche chimica degli elementi in tracce. Abbiamo quindi testato se la chimica degli oligoelementi può discriminare vertebrati e cefalopodi melanosomi occhio utilizzando sincrotrone rapida scansione a raggi X fluorescenza (SRS-XRF) e X-ray assorbimento vicino struttura del bordo (XANES) spettroscopia.

Figura 1. Anatomia degli occhi dei cefalopodi e dei vertebrati. Illustrazioni schematiche di (a) occhio di cefalopode e (b) occhio di vertebrato con, nell’inserto, dettaglio degli strati di tessuto. (c) Sezioni istologiche e micrografie elettroniche a scansione (SEM) di occhi di Loligo, Octopus, Sepia e Petromyzon. Le sezioni sono colorate con Warthin-Starry; la melanina appare nera. Tutti i tessuti mostrano microcorpi simili a melanosomi. C, coroide; I/frecce nere, iride; L, lente; O, nervo ottico; OG, gangli del nervo ottico; R, retina; RPE/*, epitelio pigmentato retinico; RPL/testa di freccia, strato pigmentato retinico; S/freccia bianca, sclera; SCL, strato subciliare; V, umore vitreo. (Versione online a colori.)

Materiale e metodi

(a) Esemplari moderni e fossili

I campioni di Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon e Dicentrachus (ciascuno n = 5) sono stati ottenuti da fornitori commerciali (Ballycotton Seafoods e K O’Connell Fish Merchants (English Market in Cork, Repubblica d’Irlanda) e Online Baits UK). Le lamprede sono state fornite congelate e sezionate immediatamente dopo lo scongelamento; i cefalopodi e il branzino erano deceduti al momento dell’acquisto e sono stati sezionati entro 24 ore dalla morte. Gli occhi sono stati fissati in glutaraldeide 2,5% per 1 ora a temperatura ambiente, disidratati in etanolo e conservati in etanolo 70% prima di ulteriori analisi.

Questo studio include l’analisi degli occhi dei seguenti otto fossili: da Mazon Creek, due esemplari di Tullimonstrum (CKGM F 6426 e FMNH PE 22061), un esemplare ciascuno dei vertebrati Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) e Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) e l’unico esemplare del cefalopode fossile Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); da Green River (Eocene, Colorado/Utah/Wyoming), un esemplare di Knightia sp. (FOBU 17591) e dalla Formazione Fur (Eocene, Danimarca) un Teterodontiformes indeterminato (NHMD 199838); dalla Lagerstätte Hâkel e Hâdjoula (Tardo Cretaceo, Libano), il polpo fossile Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Abbreviazioni istituzionali: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Natural History Museum of Denmark; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument. La coroide e il RPE dei vertebrati non potevano essere separati e quindi sono stati trattati come un unico tessuto in questa analisi. I campioni di tessuto liofilizzato (9-17 mg) sono stati omogeneizzati in acqua con un omogeneizzatore Ten-Broeck a una concentrazione di 10 mg ml-1 e aliquote da 100 µl o 200 µl trattate con AHPO e idrolisi con acido idroiodico. L’AHPO dopo idrolisi HCl verifica la presenza dell’acido pirrolo-2,3,5-tricarbossilico (un marker per l’eumelanina); l’analisi dell’acido idroiodico verifica la presenza di 4-amino-3-idrossifenilalanina (un marker per la feomelanina).

(c) Istologia

Campioni di tessuti dissezionati da occhi di cefalopodi e coroide, iride, RPE e sclera da occhi di vertebrati sono stati fissati con glutaraldeide 2,5% per 1 ora a temperatura ambiente. I campioni di tessuto fissati sono stati trattati per l’istologia e colorati utilizzando il protocollo Warthin-Starry, che verifica la presenza di melanina.

(d) Microscopia elettronica a scansione

Piccoli campioni (circa 1-2 mm2) di tessuto oculare sono stati essiccati utilizzando esametildisilazano o azoto liquido. I campioni di tessuto essiccato e le sezioni sottili non ricoperte sono stati montati su stub di alluminio, rivestiti con oro/palladio e fotografati ad una tensione di accelerazione di 5-15 keV utilizzando un FEI Quanta 650 SEM e un Zeiss Gemini Supra 40 SEM. Le analisi di spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDS) sono state condotte utilizzando un Hitachi S-3500N VP-SEM dotato di uno spettrometro a dispersione di energia EDAX Genesis ad una tensione di accelerazione di 15 kV con tempi di acquisizione di 120 s per le mappe EDS (materiale supplementare elettronico, figura S1).

(e) Analisi della geometria e delle dimensioni dei melanosomi

I dati geometrici sono stati misurati per almeno 20 melanosomi (e, ove applicabile, microcorpi simili a melanosomi) per ogni tessuto in ogni campione. Le differenze nella geometria sono state testate utilizzando ANOVA o (dove i dati sono eteroscedastici) il test F di Welch accoppiato con l’analisi post hoc a coppie in PAST (Tukey per ANOVA e Dunn per le analisi F-test di Welch, rispettivamente). I dati sulla geometria del melanosoma per S. officianalis sono omoscedastici ma non normali e quindi sono stati analizzati dopo la trasformazione logaritmica.

(f) Fluorescenza a raggi X a scansione rapida al sincrotrone

Le misurazioni sono state effettuate alle linee di luce 2-3 e 10-2 allo Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). L’energia dei raggi X incidente è stata impostata a 11 keV utilizzando un monocromatore a doppio cristallo di Si (111) con l’anello di accumulo contenente 500 mA in modalità top-off a 3.0 GeV. Alla linea di luce 2-3, un fascio microfocalizzato di 2 × 2 µm è stato fornito da una coppia di specchi Kirkpatrick-Baez rivestiti di Rh, mentre la linea di luce 10-2 ha utilizzato aperture di tungsteno per ottenere dimensioni del fascio selezionabili tra 25 e 200 µm. L’intensità dei raggi X incidente in ogni linea di fascio è stata misurata con una camera ionica riempita di azoto. I campioni sono stati montati a 45° rispetto al fascio di raggi X incidente e sono stati rasterizzati spazialmente per un tempo di permanenza di 20-50 ms pixel-1. Alla linea di luce 2-3 sono state mappate: sezioni sottili non coperte e non colorate di occhi di un individuo di Dicentrachus e Octopus e di due individui di Loligo e Petromyzon; le macchie oculari di un esemplare di Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. e dei Teterodontiformes indet. Alla linea di luce 10-2 sono stati mappati: il secondo esemplare di Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia e campioni di tessuti molli di Keuppia sp. Le due diverse linee di luce sono state utilizzate per accogliere campioni/esemplari di dimensioni diverse (esemplari troppo grandi per il palco di campionamento della linea di luce 2-3 sono stati ospitati alla 10-2). I dati fossili di ogni linea di luce sono stati calibrati rispetto allo stesso set di standard e quindi le variazioni nei dati sono reali e non riflettono variazioni nei parametri analitici. L’intero spettro di fluorescenza è stato raccolto in ogni punto dati e l’intensità delle linee di fluorescenza per elementi selezionati (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu e Zn) è stata monitorata utilizzando un rivelatore Vortex a deriva di silicio (Hitachi, USA) accoppiato ad un sistema di elaborazione degli impulsi Xpsress3 (Quantum Detectors) per la discriminazione energetica. Le intensità di fluorescenza sono state corrette per il tempo morto del rivelatore e normalizzate rispetto al flusso in entrata (I0STRM). Le concentrazioni di ogni elemento in µg cm-2 sono state calibrate usando standard elementari a film sottile tracciabili NIST. L’elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando il software MicroAnalysis Toolkit. I valori medi e la deviazione standard sono stati calcolati per le concentrazioni di ogni elemento nelle regioni di interesse selezionate. Le differenze nelle concentrazioni elementari tra le regioni di interesse sono state valutate utilizzando l’analisi discriminante lineare (LDA) in PAST. I dati sono stati raggruppati utilizzando un unico livello di classificazione corrispondente al tessuto di origine, ad esempio Octopus retina strato pigmentato (RPL), Petromyzon iride, Petromyzon sclera, FMNH PE 22061 eyespot, ecc L’analisi dei componenti principali dei dati produce una distribuzione dei dati che è quasi identica alla LDA (materiale supplementare elettronico, figura S4a,b).

(g) L’assorbimento dei raggi X vicino alla struttura del bordo della spettroscopia

XANES sono stati raccolti alla linea 2-3 della SSRL da punti di interesse identificati nelle mappe XRF. Questo è stato ottenuto guidando l’energia del fascio incidente attraverso il bordo Cu K in modo graduale e registrando l’intensità emessa della linea Kα in funzione dell’energia incidente. La calibrazione dell’energia del monocromatore è stata ottenuta utilizzando una lamina di Cu. Gli spettri XANES sono stati ottenuti dal RPL e dalla sclera di Loligo, dalla coroide di Petromyzon e dagli ocelli nell’esemplare di Tetradontiformes indet., Knightia e Tullimonstrum (CKGM F 6426). Gli spettri sono stati elaborati utilizzando il pacchetto software Athena.

Risultati

(a) Melanina e melanosomi in cefalopodi e vertebrati estanti

Inaspettatamente, diversi strati di tessuto distinti negli occhi di tutti i cefalopodi studiati mostrano una colorazione nera, specifica per la melanina (figura 1). Questi dati sono supportati da analisi AHPO, che confermano che i tessuti colorati di Loligo, Octopus e Sepia sono ricchi di eumelanina e, in misura minore, phaeomelanin (materiale supplementare elettronico, tabella S2). L’analisi al SEM dei tessuti ricchi di melanina conferma la presenza di microcorpi sferoidi/oblunghi (vedi anche; figura 1). È altamente improbabile che i microcorpi rappresentino batteri di decadimento in quanto i primi si verificano all’interno degli occhi intatti di esemplari appena uccisi senza evidenza di danni ai tessuti, mostrano una stratificazione coerente dimensione-specifica tra gli esemplari dello stesso taxon e sono stabili sotto il fascio di elettroni. Inoltre, è improbabile che i microcorpi rappresentino granuli di omocromo, poiché i primi si presentano in strati di tessuto che si colorano positivamente per la melanina in sezione istologica e contengono marcatori diagnostici per l’eumelanina nelle analisi AHPO. Non sono presenti altri microcorpi che potrebbero generare questi risultati. I microcorpi negli strati di tessuto che si colorano di nero nelle sezioni istologiche degli occhi dei cefalopodi sono quindi più plausibilmente interpretati come melanosomi.

Nei cefalopodi estanti, i melanosomi si trovano nell’iride e in ulteriori strati di tessuto situati nella parte posteriore dell’occhio (definito qui come RPL) e dietro l’iride (definito qui come lo strato subciliare (SCL); figura 1a,c). Tutti i cefalopodi studiati possiedono un SCL ma campioni di qualità istologica di questo tessuto potrebbero essere ottenuti solo per Octopus. Melanosomi differiscono significativamente nella geometria tra l’iride e RPL in entrambi Loligo (F1,90 = 7.275, p = 8.35-3) e Sepia (F1,48 = 10.94, p = 1.79-3) (figura 2a,c). Le differenze nella geometria dei melanosomi degli occhi di Octopus e Petromyzon sono statisticamente significative per alcune, ma non tutte le popolazioni di melanosomi (figura 2b,d; materiale supplementare elettronico, tabella S4). Oltre ai melanosomi, la retina dei cefalopodi contiene abbondanti granuli subangolari di forma irregolare (figura 1c). Questa geometria non è coerente con quella dei melanosomi noti nei vertebrati e nei cefalopodi; i granuli possono quindi rappresentare ommatine o altri pigmenti fotosensibili, ma la loro identità deve ancora essere dimostrata chimicamente. Vari tessuti nell’occhio della lampreda e del branzino si colorano di eu- e feomelanina (figura 1b,c); l’analisi AHPO conferma la presenza di melanina in questi tessuti e dimostra una marcata variazione nelle concentrazioni di eumelanina tra gli occhi dei due vertebrati (materiale supplementare elettronico, tabella S2).

Figura 2. Geometria dei melanosomi degli occhi. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia e (d) Petromyzon.

In sintesi, i nostri dati rivelano che i melanosomi in diversi tessuti dell’occhio hanno geometrie significativamente diverse sia nei cefalopodi che nei vertebrati (materiale supplementare elettronico, tabelle S3 e S4; figura 2).

(b) Chimica di melanosomi occhio

Abbiamo usato SRS-XRF e XANES per verificare se la chimica dei metalli in tracce può distinguere vertebrati da melanosomi occhio cefalopodi. Negli occhi del calamaro estante e polpo, solo Cu mostra sorprendente partizionamento spaziale (figura 3a,b): è arricchito nella sclera, ma non nella melanina ricca RPL (o altri tessuti). Zn mostra partizionamento sottile in entrambi i taxa cefalopodi analizzati: è leggermente arricchito nel RPL del polpo e, in misura minore, la sclera del calamaro. Nei vertebrati, tuttavia, melanosoma tessuti portanti mostrano partizionamento sorprendente di Zn (e, nella lampreda, Fe e Cu) (figura 3c,d). Nella lampreda, Fe è arricchito in iride, Zn è arricchito in iride e, soprattutto, la coroide e RPE, e Cu è arricchito in tutti i tessuti melanosoma-cuscinetto. Nel basso, Zn è arricchito in tutti i tessuti portatori di melanosomi. Nelle mappe XRF degli occhi dei vertebrati estanti, la coroide e il RPE non possono essere discriminati utilizzando la chimica degli elementi in tracce o l’ultrastruttura, rendendo necessario il loro trattamento come un unico tessuto. Non riteniamo che questo per influenzare i nostri risultati principali come i nostri dati da cefalopodi e altri tessuti oculari vertebrati mostrano che intra-specifica variazione chimica è minore rispetto alla variazione interspecifica (figura 4a, b). Tessuti ricchi di melanosoma negli occhi dei vertebrati estanti, ma non cefalopodi, sono quindi arricchiti in Zn (e talvolta Fe e Cu) rispetto ad altri tessuti oculari.

Figura 3. SRS-XRF analisi di sezioni istologiche di Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) e Dicentrachus (d), e di vertebrati fossili (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) e Knightia (f), cefalopodi fossili Keuppia (g) e Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Le sezioni istologiche sono colorate con Warthin-Starry; la melanina appare nera. SRS-XRF mappe in (a-h) sono di regioni mostrate in sezioni istologiche e fotografie. Vedere il materiale supplementare elettronico, figura S2 per le posizioni delle regioni in fotografie di sezioni istologiche e per le posizioni delle regioni in fotografie di fossili mostrato. Frecce nere, iride; punte di freccia, RPL; asterisco, RPE; frecce bianche, sclera. I valori di concentrazione massima per ogni mappa SRS-XRF sono forniti nel materiale supplementare elettronico, tabella S5. (Versione online a colori.)

Figura 4. Chimica degli oligoelementi di cefalopodi estanti e fossili e vertebrati e Tullimonstrum. (a) LDA basato su concentrazioni misurate di Ti, Fe, Cu e Zn. (b) Biplot di elementi chiave che contribuiscono alla variazione in (a). (c) Spettri XANES di campioni selezionati e standard al bordo Cu K (linea tratteggiata a 8987 eV). La maggiore variazione nella chimica tra Tullimonstrum e altri fossili Mazon Creek presenti in (a) rispetto alla variazione tra altri biotas fossili è presente anche quando Fe viene rimosso dal set di dati (materiale supplementare elettronico, figura S4c,d). Frecce in (c) indicano la posizione delle caratteristiche pre-edge in questi spettri. I dati per il sacco di inchiostro di calamaro fossile sono da .

Per verificare se questo segnale persiste nei fossili, abbiamo analizzato gli occhi in due cefalopodi fossili e quattro vertebrati fossili. Tranne che per il cefalopode Pohlsepia di Mazon Creek, le macchie oculari in tutti gli esemplari contengono microcorpi simili al melanosoma (materiale supplementare elettronico, figura S3). Le mappe SRS-XRF mostrano che le macchie oculari nei vertebrati fossili Knightia e Tetradontiformes indet. (figura 3e-f) sono arricchiti in Ti e Cu rispetto alla matrice sedimentaria, con arricchimento minore di Zn in quest’ultimo. Al contrario, il bulbo oculare di Keuppia è relativamente arricchito solo in Ti, Fe e Zn (figura 3g). L’eyespot di Tullimonstrum è arricchito in Ti, Fe, Cu e Zn rispetto ai tessuti molli circostanti (figura 3h). Questi dati chimici non sono completamente coerenti con il segnale nei cefalopodi fossili studiati o vertebrati fossili.

Abbiamo usato LDA per esplorare la variazione delle concentrazioni degli elementi chiave Ti, Fe, Cu e Zn nel nostro set di dati. Tessuti degli occhi in vertebrati estanti e cefalopodi trama in regioni separate di chemospace e separatamente alle loro controparti fossili (figura 4a,b). Criticamente, la chimica degli oligoelementi delle macchie oculari nei vertebrati inequivocabili dal Mazon Creek è distinta da entrambi gli esemplari di Tullimonstrum, che tracciano vicino. La separazione dei vertebrati inequivocabili Mazon Creek da Tullimonstrum lungo l’asse LD2 riflette l’arricchimento del primo in Zn e, in misura minore, Cu e Fe: intrigante, questo rispecchia la variazione nella chimica tra vertebrati e cefalopodi estanti. Le macchie oculari di Tullimonstrum sono, tuttavia, chimicamente distinti da quelli di Pohlsepia, un cefalopode inequivocabile dal Mazon Creek.

Abbiamo esplorato variazione nello stato di ossidazione di Cu, un metallo comunemente associato con melanina, in selezionati taxa fossili e moderni utilizzando XANES. Spettri XANES al bordo Cu K preso dalla coroide della lampreda e da due punti occhio vertebrati fossili tutti mostrano picchi di assorbimento centrato a 8994 ± 1 eV, indicando forti contributi da Cu (II) (figura 4c). Spettri dal RPL calamaro (melanizzato) e sclera (non melanizzato) ampiamente simile a quelli dei vertebrati, ma mostrano caratteristiche pre-edge a 8978.59 eV e 8977.58 eV, rispettivamente, le cui posizioni rivelano la presenza di Cu (I) . Una caratteristica pre-edge che abbraccia 8976.73-8984.27 eV appare nello spettro di Keuppia, riflettendo anche un contributo di Cu(I). La presenza di Cu(I) negli spettri XANES di ocelli di cefalopodi estinti e fossili potrebbe riflettere la riduzione di Cu(II) durante l’analisi. I campioni di vertebrati, tuttavia, non mostrano alcun contributo di Cu(I) nonostante siano stati analizzati in condizioni sperimentali identiche (gli spettri di alcuni campioni di vertebrati (ad esempio Knightia) mostrano caratteristiche pre-edge molto deboli, ma queste sono meno facilmente interpretabili come prova inequivocabile di Cu(I)). In alternativa, i contributi di Cu(I) nei tessuti oculari dei cefalopodi potrebbero derivare dall’emocianina deossigenata, la molecola respiratoria dei cefalopodi. Lo spettro XANES da Tullimonstrum dimostra un picco dominante a 8994,38 eV e una caratteristica prominente pre-edge a 8987,8-8990,2 eV. Queste caratteristiche sono coerenti con i contributi di più stati di ossidazione del Cu, incluso un distinto contributo del Cu(I), come nei cefalopodi estanti e fossili.

Discussione

Il nostro studio rivela che gli occhi dei cefalopodi estanti possiedono melanosomi con geometrie tessuto-specifiche. Il collasso dell’occhio dei cefalopodi durante il decadimento potrebbe potenzialmente generare strati di melanosomi di dimensioni specifiche, superficialmente simili a quelli del RPE dei vertebrati (figura 1a,b). La presenza di melanosomi con dimensioni e/o geometrie tessuto-specifiche negli occhi dei cefalopodi estinti (figura 2a,c) indica quindi che strati successivi di melanosomi di dimensioni e/o geometrie diverse nei fossili non possono essere automaticamente interpretati come prova del RPE dei vertebrati. La misura in cui altri gruppi di invertebrati fossili conservano melanosomi oculari è sconosciuta (ma vedi Lindgren et al. per l’evidenza chimica della melanina negli occhi degli insetti fossili).

La melanina negli occhi dei vertebrati esistenti può legare vari elementi, la cui abbondanza relativa può variare con fattori biologici e ambientali. Nei vertebrati, la melanina può sequestrare ioni metallici, potenzialmente prevenendo danni ossidativi ai tessuti. Rispetto ai vertebrati, gli occhi dei cefalopodi mostrano basse concentrazioni di metalli nei tessuti melanizzati (figura 3a,b). Questo riflette probabilmente l’abbondanza relativamente bassa di melanina (materiale supplementare elettronico, tabella S2) e suggerisce che non-melanina percorsi sono responsabili della prevenzione dei danni ai tessuti da esposizione agli ioni metallici in cefalopodi, cioè la funzione della melanina in occhi cefalopodi differisce da quella nei vertebrati. La variazione del contenuto di melanina negli occhi dei vertebrati estanti (materiale supplementare elettronico, tabella S2) potrebbe potenzialmente riflettere variazioni in ecologia e / o habitat di luce.

I nostri dati chimici sui vertebrati estanti e cefalopodi mostrano che la variazione interclade è notevolmente maggiore di quella all’interno di uno dei due gruppi (figura 3a-d). I tessuti melanizzati negli occhi dei vertebrati estanti sono arricchiti in Zn (figura 4a,b) e mostrano un forte segnale Cu (II) in spettri XANES (figura 4c), al contrario, tessuti melanizzati in cefalopodi estanti sono bassi in Zn e mostrano un contributo misto da Cu (I) e Cu (II). Allo stesso modo, melanosomi occhio in Tullimonstrum sono bassi in Zn rispetto a quelli in vertebrati Mazon Creek e spettri XANES indicano la presenza di Cu (I). Le macchie dell’occhio in Pohlsepia, tuttavia, non si sovrappongono con Tullimonstrum o con i vertebrati di Mazon Creek in LDA chemospace. La chimica dei vertebrati e cefalopodi inequivocabili nel Mazon Creek quindi non si adatta al modello generale di arricchimento degli elementi nei cefalopodi e vertebrati moderni. Collettivamente, i dati sulla morfologia e la chimica del melanosoma non sono completamente coerenti con un’affinità vertebrata per Tullimonstrum. Un’affinità con gli invertebrati non può essere esclusa, ma un’affinità con i cefalopodi non è plausibile, data l’assenza di altri caratteri morfologici diagnostici.

La struttura chimica della melanina è nota per essere alterata dai cambiamenti di pH e dall’esposizione a elevate concentrazioni di metalli, pressioni e temperature, tutte cose che si verificano comunemente durante la diagenesi. E ‘quindi probabile che i melanosomi in diversi taxa fossili dalla stessa biotas o diversi possono seguire diversi percorsi diagenetici, con conseguente chimica degli elementi in tracce disparate (come è evidente negli studi della geochimica organica di melanine fossili). La variazione chimica tra i fossili qui osservata (figura 3e-h) riflette presumibilmente la variazione nella litologia ospite e/o nella storia diagenetica. Per esempio, l’assenza di melanosomi conservati in Pohlsepia suggerisce che questo esemplare ha subito un’alterazione più estesa durante la diagenesi rispetto agli altri esemplari fossili analizzati. Inoltre, la variazione nella chimica degli oligoelementi tra i fossili di Mazon Creek è maggiore rispetto ai fossili di tutte le altre biotas. Questo suggerisce che la diagenesi chimica dei melanosomi nei fossili di Mazon Creek è più variabile di quella di altri biotas, precludendo un’interpretazione conclusiva della chimica originale degli oligoelementi. Tuttavia, gli occhi di Knightia e l’esemplare di Tetradontiformes indet. hanno firme simili di oligoelementi pur provenendo da biotas diverse e quindi presumibilmente avendo storie diagenetiche diverse. Futuri studi mirati alla risposta della chimica degli oligoelementi del melanosoma a vari fattori diagenetici, ad esempio pH, litologia, pressione e temperatura, sarà fondamentale per la discriminazione della chimica originale dai prodotti chimici della diagenesi.

Accessibilità dei dati

Si forniscono tutti i dati nel testo principale, materiale supplementare elettronico o tramite il Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Contributi degli autori

C.S.R. e T.I.A. hanno eseguito l’istologia; C.S.R., T.I.A. e M.E.M. hanno eseguito il SEM; C.S.R., M.E.M. e S.M.W. hanno eseguito la scansione rapida al sincrotrone – fluorescenza a raggi X e spettroscopia di assorbimento a raggi X (XAS); S.I. e K.W. hanno eseguito le analisi AHPO; C.S.R. e M.E.M. hanno scritto il manoscritto con il contributo di tutti gli altri autori.

Interessi concorrenti

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Finanziamento

Sostenuto da European Research Starting Grant (grant no. ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) assegnato a M.E.M. L’uso dello Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, è sostenuto dal Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences sotto contratto no. DE-AC02-76SF00515.

Riconoscimenti

Ringraziamo A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson e A. Stroup per l’accesso ai campioni; N. Edwards per il supporto XAS; V. Rossi e R. Wogelius per la discussione.

Footnotes

Il materiale supplementare elettronico è disponibile online a https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Pubblicato dalla Royal Society. Tutti i diritti riservati.

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