Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopoda: implications for the affinity of Tullimonstrum

Introduction

Screening pigments are an essential component of visual systems in animals as they absorb errant light, thus enabling directional photoreception and the protection of photoreceptors from ultraviolet radiation . A gerinctelenek szűrőpigmentjei közé tartoznak az ommokrómok, a pterinek és ritkábban a melanin . Ezzel szemben a gerincesek elsődleges szűrőpigmentje a melanin, amely melanoszómák (membránhoz kötött organellumok) formájában fordul elő az íriszben, a chorioideában, a retina pigmentált epitheliumában (RPE) és a szklerában (1. ábra). Az RPE melanoszómák között vannak gömb alakú és hosszúkás formák, amelyek térben feloszlanak . Erős beeső fényben a hosszúkás melanoszómák az RPE-sejtek apikális nyúlványaihoz vándorolnak, így védve a fényérzékeny pigmenteket a fotoreceptorsejtekben a kifehéredéstől. Érdekes módon a Tullimonstrum gregarium rejtélyes taxon (karbon, Mazon Creek, IL, USA) szemében is különböző geometriájú melanoszómák egymást követő rétegei találhatók. Ezt a jellegzetességet a ma élő állatok melanoszóma-eloszlásának és morfológiájának áttekintése alapján a gerinces rokonság bizonyítékaként értelmezték. Az azonban, hogy a gerinctelen szemmelanoszómák a gerincesekhez hasonlóan egymás után következő szöveti rétegekbe szerveződnek-e, nem ismert. Ennek tisztázása a gerinctelen szemek szűrőpigmentjeinek szisztematikus vizsgálatát igényli. A lábasfejűek ideális kísérleti esetet jelentenek, mivel a gerincesekhez hasonlóan bonyolult kameraszerű szemmel rendelkeznek, amely több pigmentált szöveti réteggel rendelkezik, és ismert, hogy melanoszómákat termelnek (a tintazsákban ). Szisztematikusan jellemeztük a pigmentált szövetek anatómiai elhelyezkedését és kémiáját, valamint a pigmentszemcsék geometriáját a közönséges polip (Octopus vulgaris), az európai tintahal (Loligo vulgaris), a közönséges tintahal (Sepia officianalis), a tengeri lampion (Petromyzon marinus) és az európai sügér (Dicentrachus labrax) szemében, összekapcsolva a kövületekből származó adatokkal (elektronikus kiegészítő anyag, S1. táblázat). A szöveteket Warthin-Starry szövettani festéssel, lúgos hidrogén-peroxidos oxidációval (AHPO ) és pásztázó elektronmikroszkópiával (SEM) elemeztük. A gerincesek szemében a melanin a fémionok kelátképzésével csökkenti az oxidatív stresszt, és a legújabb munkák azt mutatják, hogy a gerincesek melanoszómái szövetspecifikus nyomelem-kémiával rendelkeznek . Ezért megvizsgáltuk, hogy a nyomelem-kémia képes-e megkülönböztetni a gerincesek és a fejlábúak szemének melanoszómáit szinkrotron gyors pásztázó röntgenfluoreszcencia (SRS-XRF) és röntgenabszorpciós, élszerkezet közeli röntgensugárzás (XANES) spektroszkópia segítségével.

1. ábra. A fejlábúak és a gerincesek szemének anatómiája. A fejlábúak szemének (a) és a gerincesek szemének (b) sematikus ábrái a szöveti rétegek részleteivel. (c) Loligo, Octopus, Sepia és Petromyzon szemének szövettani metszetei és pásztázó elektronmikroszkópos felvételei (SEM). A metszeteket Warthin-Starry festékkel festettük; a melanin feketén jelenik meg. Minden szövetben melanoszóma-szerű mikrotestek láthatók. C, chorioidea; I/fekete nyilak, írisz; L, lencse; O, látóideg; OG, látóideg ganglionok; R, retina; RPE/*, retinális pigment epithelium; RPL/nyílhegyek, retinális pigmentált réteg; S/fehér nyíl, sclera; SCL, subciliaris réteg; V, üvegtest. (Színes online változat.)

Anyag és módszerek

(a) Modern és fosszilis példányok

A Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon és Dicentrachus példányait (egyenként n = 5) kereskedelmi beszállítóktól (Ballycotton Seafoods és K O’Connell Fish Merchants (English Market in Cork, Ír Köztársaság) és Online Baits UK) szereztük be. A lámpáshalakat fagyasztva szállították, és felolvasztás után azonnal felboncolták; a fejlábúak és az európai sügérek a vásárláskor már elpusztultak, és a halálukat követő 24 órán belül boncolták fel őket. A szemeket 2,5%-os glutaraldehidben 1 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük, majd etanolban dehidratáltuk és 70%-os etanolban tároltuk a további elemzés előtt.

Ez a tanulmány a következő nyolc fosszília szemgödreinek elemzését tartalmazza: Mazon Creekből a Tullimonstrum két példánya (CKGM F 6426 és FMNH PE 22061), a Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) és a Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) gerincesek egy-egy példánya, valamint a Pohlsepia mazonensis fosszilis fejlábú egyetlen példánya (FMNH PE 51727); a Green Riverből (eocén, Colorado/Utah/Wyoming) egy példány a Knightia sp. (FOBU 17591) és a Fur-formációból (eocén, Dánia) egy meghatározatlan Teterodontiformes (NHMD 199838); a Hâkel és Hâdjoula Lagerstätte-ból (késő kréta, Libanon) a Keuppia sp. fosszilis polip (NHMUK PICC651A). Intézeti rövidítések: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Natural History Museum of Denmark; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Lúgos hidroxid-peroxidos oxidáció és hidrojódsavas hidrolízis

A szöveteket steril eszközökkel boncoltuk, üvegfiolákba helyeztük, fagyasztva szárítottuk és porítottuk. A gerincesek chorioideáját és az RPE-t nem lehetett szétválasztani, ezért ebben az elemzésben egyetlen szövetként kezeltük. A fagyasztva szárított szövetmintákat (9-17 mg) 10 mg ml-1 koncentrációban vízben Ten-Broeck homogenizátorral homogenizáltuk, és 100 µl vagy 200 µl aliquotokat dolgoztunk fel AHPO és hidrojódsavas hidrolízis segítségével . Az AHPO a HCl-hidrolízis után a pirrol-2,3,5-trikarbonsav (az eumelanin markere) jelenlétét vizsgálja; a hidrojódsavas elemzés a 4-amino-3-hidroxi-fenilalanin (a faeomelanin markere) jelenlétét vizsgálja.

(c) Hisztológia

A fejlábúak szeméből származó szövetmintákat és a gerincesek szeméből származó chorioideát, íriszt, RPE-t és sclerát 2,5%-os glutaraldehiddel 1 órán át szobahőmérsékleten fixáltuk. A rögzített szövetmintákat szövettanilag feldolgoztuk, és a Warthin-Starry protokoll szerint festettük meg, amely a melanin jelenlétét vizsgálja.

(d) Pásztázó elektronmikroszkópia

A szemszövetekből vett kis mintákat (kb. 1-2 mm2 ) hexametil-diszilazánnal vagy folyékony nitrogénnel szárítottuk. A szárított szövetmintákat és a lefedetlen vékony metszeteket alumínium csonkokra szereltük, arany/palládium porlasztással bevontuk, és 5-15 keV gyorsítófeszültségen képet készítettünk egy FEI Quanta 650 SEM és egy Zeiss Gemini Supra 40 SEM segítségével. Az energiadiszperzív röntgenspektroszkópiai (EDS) elemzéseket egy EDAX Genesis energiadiszperzív spektrométerrel felszerelt Hitachi S-3500N VP-SEM-mel végeztük 15 kV gyorsítófeszültségen, az EDS-térképek 120 s felvételi idővel (elektronikus kiegészítő anyag, S1 ábra).

(e) A melanoszómák geometriájának és méretének elemzése

A melanoszómák geometriájának adatait minden mintában minden szövet esetében legalább 20 melanoszómára (és adott esetben melanoszóma-szerű mikrotestre) vonatkozóan mértük. A geometria különbségeit ANOVA vagy (ahol az adatok heteroszkedasztikusak) Welch F-tesztje segítségével vizsgáltuk, páros post hoc elemzéssel párosítva a PAST-ban (Tukey az ANOVA és Dunn a Welch F-teszt elemzésekhez) . A S. officianalisra vonatkozó melanoszóma-geometriai adatok homoszkedasztikusak, de nem normálisak, ezért log-transzformáció után elemeztük őket.

(f) Szinkrotron gyors pásztázó röntgenfluoreszcencia

A méréseket a Stanford Synchrotron Sugárzási Fényforrás (SSRL) 2-3 és 10-2 sugárvonalain végeztük. A beeső röntgenenergiát 11 keV-ra állítottuk be egy Si (111) kettős kristály monokromátorral, amelynek tárológyűrűje 500 mA-t tartalmazott top-off üzemmódban 3,0 GeV-on. A 2-3-as sugárvonalnál a 2 × 2 µm-es mikrofókuszált sugárnyalábot egy Rh-bevonatú Kirkpatrick-Baez tükörpár biztosította, míg a 10-2-es sugárvonalnál volfrámapertúrákat használtak a 25 és 200 µm közötti választható sugárméret eléréséhez. A beeső röntgensugárzás intenzitását minden sugárvonalnál nitrogénnel töltött ionkamrával mértük. A mintákat a beeső röntgensugárhoz képest 45°-ban szerelték fel, és 20-50 ms pixel-1 tartózkodási idővel térbeli raszterezést végeztek. A 2-3. sugárvonalon a következőket térképeztük fel: a Dicentrachus és az Octopus egy-egy egyedének, valamint a Loligo és a Petromyzon két egyedének fedetlen és festetlen vékony szemmetszetei; a Tullimonstrum egy példányának (CKGM F 6426), a Knightia sp. és a Teterodontiformes indet. A 10-2 sugárvonalon a következőket térképeztük fel: a Tullimonstrum második példányát (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia és a Keuppia sp. lágyszövetmintáit. A két különböző sugárvonalat a különböző méretű minták/egyedek befogadására használtuk (a 2-3-as sugárvonalon a mintavételi színpadhoz túl nagy példányokat a 10-2-n fogadtuk be). Az egyes sugárvonalakról származó fosszilis adatokat ugyanazzal a szabványkészlettel kalibrálták, így az adatok eltérései valósak, és nem az analitikai paraméterek eltéréseit tükrözik. A teljes fluoreszcencia-spektrumot minden egyes adatponton összegyűjtöttük, és a kiválasztott elemek (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu és Zn) fluoreszcencia-vonalainak intenzitását egy szilícium drift Vortex detektorral (Hitachi, USA) követtük nyomon, amelyet az energia megkülönböztetéséhez egy Xpsress3 impulzusfeldolgozó rendszerrel (Quantum Detectors) kapcsoltunk össze. A fluoreszcencia-intenzitásokat korrigáltuk a detektor holtidejével, és a bejövő fluxussal szemben normalizáltuk (I0STRM). Az egyes elemek µg cm-2 -ben kifejezett koncentrációit NIST nyomon követhető vékonyfilmes elemszabványok segítségével kalibráltuk. Az adatfeldolgozást a MicroAnalysis Toolkit szoftverrel végeztük. Az egyes elemek koncentrációinak átlagát és szórását a kiválasztott, érdekes régiókban számítottuk ki. Az elemkoncentrációk közötti különbségeket a PAST programban lineáris diszkriminancia-analízis (LDA) segítségével értékeltük. Az adatokat a származási szövetnek megfelelő egyetlen osztályozási szint segítségével csoportosítottuk, pl. Octopus retina pigmentált réteg (RPL), Petromyzon írisz, Petromyzon sclera, FMNH PE 22061 szemfolt stb. Az adatok főkomponens-elemzése az adatoknak az LDA-val közel azonos eloszlását eredményezi (elektronikus kiegészítő anyag, S4a,b ábra).

(g) Röntgenabszorpciós élszerkezet-közeli spektroszkópia

XANES-spektrumokat gyűjtöttünk az SSRL 2-3-as sugárvonalán az XRF-térképeken azonosított érdekes pontokról. Ezt úgy értük el, hogy a beeső sugár energiáját fokozatosan vezettük át a Cu K élén, és a Kα vonal emittált intenzitását rögzítettük a beeső energia függvényében . A monokromátor energiájának kalibrálása egy Cu fólia segítségével történt. XANES-spektrumokat nyertünk a Loligo RPL és sclera, a Petromyzon chorioideájából, valamint a Tetradontiformes indet., Knightia és Tullimonstrum (CKGM F 6426) példány szemgödreiből. A spektrumokat az Athena szoftvercsomaggal dolgoztuk fel.

Eredmények

(a) Melanin és melanoszómák a fejlábúak és a gerincesek szemében

Nem várt módon valamennyi vizsgált fejlábú szemében több különböző szöveti réteg fekete, melanin-specifikus festődést mutat (1. ábra). Ezeket az adatokat alátámasztják az AHPO-elemzések, amelyek megerősítik, hogy a Loligo, az Octopus és a Sepia festett szövetei eumelaninban és kisebb mértékben faeomelaninban gazdagok (elektronikus kiegészítő anyag, S2. táblázat). A melaninban gazdag szövetek SEM-elemzése megerősíti a gömbölyded/nyúlványos mikrotestek jelenlétét (lásd még ; 1. ábra). Nagyon valószínűtlen, hogy a mikrotestek bomlásbaktériumokat képviselnek, mivel az előbbiek a frissen leölt példányok ép szemében fordulnak elő, a szövetkárosodásra utaló jelek nélkül, az azonos taxonhoz tartozó példányok között következetes méretspecifikus rétegződést mutatnak, és az elektronsugár alatt stabilak. Továbbá a mikrotestek nem valószínű, hogy ommokróm szemcséket képviselnek, mivel az előbbiek olyan szöveti rétegekben fordulnak elő, amelyek szövettani metszetben pozitívan festődnek melaninra, és az AHPO-elemzések során eumelanin diagnosztikus markereket tartalmaznak. Más mikrotestek nincsenek jelen, amelyek ezeket az eredményeket létrehozhatnák. A fejlábúak szemének szövettani metszeteiben feketére festődő szövetrétegekben található mikrotestek így a legvalószínűbben melanoszómaként értelmezhetők.

A fejlábúaknál a melanoszómák az íriszben és a szem hátsó részén (itt RPL-ként definiálva) és az írisz mögött (itt szubciliáris rétegként (SCL) definiálva; 1a,c ábra) található további szövetrétegekben fordulnak elő. Minden vizsgált fejlábú rendelkezik SCL-lel, de csak az Octopus esetében sikerült szövettani minőségű mintákat szerezni ebből a szövetből. A melanoszómák geometriája jelentősen különbözik az írisz és az RPL között mind a Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3), mind a Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) esetében (2a,c ábra). Az Octopus és a Petromyzon szemmelanoszómáinak geometriájában mutatkozó különbségek statisztikailag szignifikánsak néhány, de nem minden melanoszómapopuláció esetében (2b,d ábra; elektronikus kiegészítő anyag, S4. táblázat). A melanoszómákon kívül a fejlábúak retinája bőségesen tartalmaz szubszögletes, szabálytalan alakú szemcséket (1c. ábra). Ez a geometria nem egyezik a gerincesek és a fejlábúak ismert melanoszómáinak geometriájával; a szemcsék tehát ommatinokat vagy más fényérzékeny pigmenteket képviselhetnek, de azonosságukat kémiailag még nem sikerült bizonyítani. A lamantin és a sügér szemének különböző szövetei eu- és faeomelaninra festődnek (1b,c ábra); az AHPO-analízis megerősíti a melanin jelenlétét ezekben a szövetekben, és jelentős eltéréseket mutat a két gerinces szemének eumelanin-koncentrációjában (elektronikus kiegészítő anyag, S2. táblázat).

2. ábra. A szem melanoszómáinak geometriája. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia és (d) Petromyzon.

Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy a szem különböző szöveteiben lévő melanoszómák geometriája jelentősen eltér a fejlábúak és a gerincesek között (elektronikus kiegészítő anyag, S3 és S4 táblázat; 2. ábra).

(b) A szemmelanoszómák kémiája

Megvizsgáltuk SRS-XRF és XANES segítségével, hogy a nyomfémek kémiája képes-e megkülönböztetni a gerincesek és a fejlábúak szemmelanoszómáit. A ma élő tintahalak és polipok szemében csak a Cu mutat feltűnő térbeli megoszlást (3a,b ábra): a szklerában feldúsul, de a melaninban gazdag RPL-ben (vagy más szövetekben) nem. A Zn mindkét vizsgált fejlábú taxonban finom megoszlást mutat: a polip RPL-ében és – kisebb mértékben – a tintahal szklerájában enyhén feldúsul. A gerinceseknél azonban a melanoszómákat hordozó szövetekben a Zn (és a lámpásnál a Fe és a Cu) feltűnő megoszlása figyelhető meg (3c,d ábra). A lampionban a Fe az íriszben, a Zn az íriszben és különösen a chorioideában és az RPE-ben, a Cu pedig az összes melanoszómát hordozó szövetben dúsul. A sügérben a Zn minden melanoszómát hordozó szövetben feldúsul. A gerincesek szemének XRF-térképén a chorioidea és az RPE nem különböztethető meg a nyomelem-kémia vagy az ultrastruktúra alapján, ezért egyetlen szövetként kell kezelni őket. Úgy véljük, hogy ez nem befolyásolja fő eredményeinket, mivel a fejlábúak és más gerincesek szemszöveteiből származó adataink azt mutatják, hogy a fajon belüli kémiai eltérés csekély a fajok közötti eltéréshez képest (4a,b ábra). A gerincesek, de nem a fejlábúak szemének melanoszómában gazdag szövetei tehát Zn-ben (és néha Fe-ben és Cu-ban) gazdagabbak más szemszövetekhez képest.

3. ábra. Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) és Dicentrachus (d), valamint fosszilis gerincesek (Teleostei) Tetradontiformes indet fosszilis gerincesek szövettani metszeteinek SRS-XRF elemzése. (e) és Knightia (f), fosszilis fejlábúak Keuppia (g) és Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). A szövettani metszeteket Warthin-Starry festékkel festettük; a melanin feketén jelenik meg. Az SRS-XRF-térképek (a-h) a szövettani metszeteken és a fényképeken látható régiókról készültek. Lásd az elektronikus kiegészítő anyag S2. ábráját a szövettani metszetek fotóin látható régiók helyét, valamint az ábrázolt fosszíliák fotóin látható régiók helyét. Fekete nyilak, írisz; nyílhegyek, RPL; csillag, RPE; fehér nyilak, szklera. Az egyes SRS-XRF-térképek maximális koncentrációs értékeit az elektronikus kiegészítő anyag S5. táblázata tartalmazza. (Színes online változat.)

4. ábra. Keletkezett és fosszilis fejlábúak és gerincesek, valamint Tullimonstrum nyomelem-kémiája. (a) LDA a Ti, Fe, Cu és Zn mért koncentrációi alapján. (b) Az (a) pontban szereplő eltérésekhez hozzájáruló legfontosabb elemek biplotja. (c) Kiválasztott minták és standardok XANES-spektrumai a Cu K peremén (szaggatott vonal 8987 eV-nál). A Tullimonstrum és más Mazon Creek-i fosszíliák közötti nagyobb kémiai eltérés, amely az (a) pontban látható, a többi fosszilis biota közötti eltéréshez képest akkor is jelen van, ha a Fe-t eltávolítjuk az adathalmazból (elektronikus kiegészítő anyag, S4c,d ábra). A (c) ábrán a nyílhegyek a spektrumokban a szegély előtti vonások helyzetét jelzik. A fosszilis tintahalak tintazsákjára vonatkozó adatok .

Hogy teszteljük, hogy ez a jel fennmarad-e a fosszíliákban, két fosszilis fejlábú és négy fosszilis gerinces állat szemfoltjait elemeztük. A Mazon Creek-i Pohlsepia fejlábú kivételével a szemfoltok minden példányban melanoszóma-szerű mikrotesteket tartalmaznak (elektronikus kiegészítő anyag, S3 ábra). Az SRS-XRF-térképek azt mutatják, hogy a Knightia és a Tetradontiformes indet. (3e-f ábra) az üledékes mátrixhoz képest Ti-ben és Cu-ban gazdagodtak, az utóbbiban a Zn kisebb mértékben gazdagodott. Ezzel szemben a Keuppia szemfoltja viszonylag csak Ti-ben, Fe-ben és Zn-ben gazdagodott (3g. ábra). A Tullimonstrum szemfoltja Ti-ben, Fe-ben, Cu-ban és Zn-ben gazdagodott a környező lágyszövetekhez képest (3h. ábra). Ezek a kémiai adatok nem állnak teljes összhangban a vizsgált fosszilis fejlábúak vagy fosszilis gerincesek jelével.

LDA-t használtunk arra, hogy feltárjuk a Ti, Fe, Cu és Zn kulcselemek koncentrációjának változását az adathalmazunkban. A ma élő gerincesek és a fejlábúak szemszövetei a kemoszféra külön régióiban és a fosszilis társaiktól elkülönülten ábrázolódnak (4a,b ábra). Kritikusan fontos, hogy a Mazon patakból származó egyértelmű gerincesek szemcséinek nyomelem-kémiája különbözik a Tullimonstrum mindkét példányától, amelyek közel helyezkednek el egymáshoz. Az egyértelmű Mazon Creek-i gerincesek és a Tullimonstrum elkülönülése az LD2 tengely mentén az előbbiek Zn-ben, és kisebb mértékben Cu-ban és Fe-ben való gazdagodását tükrözi: érdekes módon ez tükrözi az élő gerincesek és a fejlábúak közötti kémiai eltéréseket. A Tullimonstrum szemcséi azonban kémiailag különböznek a Mazon patakból származó Pohlsepia, egy egyértelműen fejlábú fejlábúéitól.

XANES segítségével vizsgáltuk a Cu – a melaninhoz gyakran társuló fém – oxidációs állapotának változását kiválasztott fosszilis és modern taxonokban. A lámpás kéreghártyájából és két fosszilis gerinces szemfoltjából vett XANES-spektrumok a Cu K élén mind 8994 ± 1 eV-nál központosított abszorpciós csúcsokat mutatnak, ami a Cu(II) erős hozzájárulását jelzi (4c. ábra). A tintahal RPL (melanizált) és a szklerából (nem melanizált) származó spektrumok nagyjából hasonlítanak a gerincesekéhez, de 8978,59 eV-nál és 8977,58 eV-nál előcsúcsokat mutatnak, amelyek pozíciója Cu(I) jelenlétéről árulkodik. A Keuppia spektrumában megjelenik egy 8976,73-8984,27 eV közötti előcsúcs-vonás, amely szintén Cu(I) hozzájárulást tükröz. A Cu(I) jelenléte az élő és a fosszilis fejlábúak szemgödreinek XANES-spektrumában a Cu(II) redukcióját tükrözheti az elemzés során. A gerinces minták azonban nem mutatják a Cu(I) hozzájárulását, annak ellenére, hogy azonos kísérleti körülmények között elemezték őket (néhány gerinces minta (pl. Knightia) spektrumában nagyon gyenge élek előtti vonások láthatók, de ezek kevésbé értelmezhetők a Cu(I) egyértelmű bizonyítékaként). Alternatívaként a Cu(I) hozzájárulások a fejlábúak szemszöveteiben a fejlábúak légzési molekulájából, a dezoxigénezett hemocianinból származhatnak. A Tullimonstrumból származó XANES-spektrum egy domináns csúcsot mutat 8994,38 eV-nál és egy kiemelkedő előcsúcsot 8987,8-8990,2 eV-nál. Ezek a jellemzők összhangban vannak a több Cu oxidációs állapotból származó hozzájárulásokkal, beleértve egy határozott Cu(I) hozzájárulást , mint a kihalt és a fosszilis fejlábúaknál.

Diszkusszió

A tanulmányunk feltárja, hogy a kihalt fejlábúak szemei szövetspecifikus geometriájú melanoszómákkal rendelkeznek. A fejlábúak szemének összeesése a bomlás során potenciálisan a gerincesek RPE-jéhez felületileg hasonló, méret-specifikus melanoszómarétegeket hozhat létre (1a,b ábra). A szövetspecifikus méretű és/vagy geometriájú melanoszómák jelenléte a ma élő fejlábúak szemében (2a,c ábra) ezért azt jelzi, hogy a különböző méretű és/vagy geometriájú melanoszómák egymást követő rétegeit a kövületekben nem lehet automatikusan a gerincesek RPE-jének bizonyítékaként értelmezni. Az, hogy más fosszilis gerinctelen csoportok milyen mértékben őrzik a szemmelanoszómákat, nem ismert (de lásd Lindgren et al. kémiai bizonyítékát a melaninra a fosszilis rovarok szemében).

A melanin a ma élő gerincesek szemében különböző elemeket képes megkötni, amelyek relatív gyakorisága biológiai és környezeti tényezők függvényében változhat . A gerinceseknél a melanin képes fémionokat megkötni, potenciálisan megakadályozva az oxidatív szövetkárosodást . A gerincesekhez képest a fejlábúak szeme alacsony fémkoncentrációt mutat a melanizált szövetekben (3a,b ábra). Ez valószínűleg a melanin viszonylag alacsony mennyiségét tükrözi (elektronikus kiegészítő anyag, S2. táblázat), és arra utal, hogy a fejlábúaknál a fémion-expozíció okozta szövetkárosodás megelőzéséért nem a melanin útjai felelősek, azaz a melanin funkciója a fejlábúak szemében eltér a gerincesekétől. A gerincesek szemének melanin-tartalmában mutatkozó eltérések (elektronikus kiegészítő anyag, S2. táblázat) potenciálisan az ökológia és/vagy a fényviszonyok eltéréseit tükrözhetik.

A gerincesekre és a fejlábúakra vonatkozó kémiai adataink azt mutatják, hogy a kládok közötti eltérés lényegesen nagyobb, mint bármelyik csoporton belül (3a-d. ábra). A kihalt gerincesek szemének melanizált szövetei Zn-ben gazdagok (4a,b ábra) és erős Cu(II)-jelet mutatnak a XANES-spektrumokban (4c ábra); ezzel szemben a kihalt fejlábúak melanizált szövetei alacsony Zn-tartalmúak és a Cu(I) és Cu(II) vegyes hozzájárulását mutatják. Hasonlóképpen, a Tullimonstrum szemmelanoszómái alacsony Zn-tartalmúak a Mazon Creek gerincesekéhez képest, és a XANES-spektrumok Cu(I) jelenlétére utalnak. A Pohlsepia szemfoltjai azonban nem illeszkednek a Tullimonstrumhoz vagy a Mazon Creek gerincesekhez az LDA kemospace-ben. A Mazon Creek-i egyértelmű gerincesek és fejlábúak kémiája tehát nem illeszkedik a modern fejlábúak és gerincesek elemdúsulásának általános mintázatához. Összességében a melanoszómák morfológiájára és kémiájára vonatkozó adatok nem állnak teljesen összhangban a Tullimonstrum gerinces rokonságával. A gerinctelen rokonság nem zárható ki, de a fejlábúak rokonsága valószínűtlen, tekintettel más diagnosztikus morfológiai jellemzők hiányára .

A melanin kémiai szerkezete közismerten megváltozik a pH változása és a megnövekedett fémkoncentrációnak , nyomásnak és hőmérsékletnek való kitettség következtében, amelyek mind a diagenezis során gyakran előfordulnak. Ezért valószínű, hogy az azonos vagy különböző biotákból származó különböző fosszilis taxonok melanoszómái különböző diagenetikus utakat követhetnek, ami eltérő nyomelem-kémiát eredményezhet (amint az a fosszilis melaninok szerves geokémiájával kapcsolatos vizsgálatokból kiderül ). Az itt megfigyelt kémiai eltérések a fosszíliák között (3e-h ábra) feltehetően a gazdatest litológiájának és/vagy diagenetikus történetének eltéréseit tükrözik. Például a Pohlsepia esetében a megmaradt melanoszómák hiánya arra utal, hogy ez a példány a diagenezis során nagyobb mértékű alteráción ment keresztül, mint a többi elemzett fosszilis példány. Továbbá a Mazon Creek-i fosszíliák között a nyomelem-kémiai eltérések nagyobbak, mint az összes többi biotából származó fosszíliák esetében. Ez arra utal, hogy a Mazon Creek-i kövületek melanoszómáinak kémiai diagenezise változatosabb, mint a többi biota esetében, ami kizárja az eredeti nyomelem-kémia meggyőző értelmezését. Mindazonáltal a Knightia szemei és a Tetradontiformes indet. példánya hasonló nyomfém-szignatúrával rendelkeznek annak ellenére, hogy különböző biotákból származnak, és így feltehetően eltérő diagenetikus történettel rendelkeznek. A jövőbeni vizsgálatok, amelyek a melanoszóma nyomelem-kémiájának a különböző diagenetikus tényezőkre – pl. pH, litológia, nyomás és hőmérséklet – adott válaszát célozzák meg, kritikus fontosságúak lesznek az eredeti kémia és a diagenezis kémiai termékeinek megkülönböztetéséhez.

Adatok hozzáférhetősége

Az összes adatot a főszövegben, az elektronikus kiegészítő anyagban vagy a Dryad Digital Repository-n keresztül biztosítjuk: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

A szerzők hozzájárulása

C.S.R. és T.I.A. végezte a szövettant; C.S.R., T.I.A. és M.E.M. végezte a SEM-et; C.S.R., M.E.M. és S.M.W. végezték a szinkrotron gyors letapogatást – röntgenfluoreszcencia és röntgenabszorpciós spektroszkópia (XAS); S.I. és K.W. végezték az AHPO elemzéseket; C.S.R. és M.E.M. írták a kéziratot az összes többi szerző közreműködésével.

Kompetitív érdekek

A szerzők nem jelentenek be konkurens érdekeket.

Finanszírozás

Az M.E.M. számára odaítélt európai kutatási induló támogatás (ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO sz. támogatás) keretében támogatta a Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory használatát az USA Energiaügyi Minisztériuma, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences által a contract no. DE-AC02-76SF00515.

Acknowledgements

Köszönjük A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson és A. Stroup számára a mintákhoz való hozzáférést; N. Edwardsnak a XAS-támogatást; V. Rossi and R. Wogelius for discussion.

Footnotes

Electronic supplementary material is available online at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. All rights reserved.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015How complexity originations: the evolution of animal eyes. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016A Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, karbon) szemei gerinces rokonságról árulkodnak. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Comparisons of the structural and chemical properties of melanosomes isolated from retinal pigment epithelium, iris and choroid of newborn and mature bovine eyes. Photochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012A melanin intraokuláris eloszlása emberi, majom-, nyúl-, minisertés- és kutyaszemekben. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optikai koherencia tomográfia a fény által vezérelt melanoszóma-transzlokációról a retinális pigment epitéliumban. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000A szemek evolúciója. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogenesis in the ink gland of Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fine structure of melanogenesis in the ink sac of Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolysis reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002A 4-amino-3-hidroxi-fenilalanin hasznossága mint a pheomelanin specifikus markere. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissue-specific geometry and chemistry of modern and fossilized melanosomes reveal internal anatomy of extinct vertebrates. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analyse histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: paleontológiai statisztikai szoftvercsomag oktatáshoz és adatelemzéshez. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011The microanalysis toolkit: Röntgenfluoreszcencia képfeldolgozó szoftver. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S0909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Immunoelectron-microscopic study of G-protein distribution on photoreceptor cells of the cephalopoda Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987A réz oxidációs állapotának és koordinációs számának röntgenabszorpciós élének meghatározása: alkalmazás a Rhus vernicifera Laccase 3. típusú helyére és oxigénnel való reakciójára. J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse immune functions of hemocyanins. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al.. 2019Fosszilis rovarszemek fényt vetnek a trilobiták optikájára és az ízeltlábúak pigmentszűrőjére. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Physical and chemical characterization of iris and choroid melanosomes isolated from newborn and mature cows. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017The ‘Tully Monster’ is not a vertebrate: characters, convergence and taphonomy in Palaeozoic problematic animals. Palaeontology 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. In Mazon creek fossils (szerk. Nitecki MH), pp. 269-301. New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. In The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitive soft-bodied cephalopods from the Cambrian. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorption of Pb(II) and Cd(II) by squid Ommastrephes bartrami melanin. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically altered melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Data from: Synchrotron X-ray absorption spectroscopy of melanosomes in vertebrates and cephalopoda: implications for the affinity of Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar