Espectroscopia de absorción de rayos X de sincrotrón de melanosomas en vertebrados y cefalópodos: implicaciones para la afinidad del Tullimonstrum

Introducción

Los pigmentos cribadores son un componente esencial de los sistemas visuales de los animales, ya que absorben la luz errante, permitiendo así la fotorrecepción direccional y la protección de los fotorreceptores de la radiación ultravioleta . Los pigmentos de cribado de los invertebrados incluyen los omocromos, las pterinas y, con menor frecuencia, la melanina . En cambio, el principal pigmento de cribado en los vertebrados es la melanina, que se presenta en forma de melanosomas (orgánulos unidos a la membrana) en el iris, la coroides, el epitelio pigmentado de la retina (EPR) y la esclerótica (figura 1). Los melanosomas del EPR incluyen formas esféricas y alargadas que están divididas espacialmente. En caso de luz brillante, los melanosomas alargados migran a los procesos apicales de las células del EPR, protegiendo así los pigmentos fotosensibles de las células fotorreceptoras de la decoloración. Curiosamente, los ojos del enigmático taxón Tullimonstrum gregarium (Carbonífero, Mazon Creek, IL, EE.UU.) también presentan capas sucesivas de melanosomas de diferentes geometrías. Esta característica se interpretó como una prueba de la afinidad con los vertebrados, basándose en una revisión de la distribución y morfología de los melanosomas en los animales existentes. Sin embargo, se desconoce si los melanosomas de los ojos de los invertebrados están organizados en capas tisulares sucesivas como en los vertebrados. Para resolver esto se requiere una investigación sistemática de los pigmentos de cribado en los ojos de los invertebrados. Los cefalópodos son un caso de prueba ideal porque, al igual que los vertebrados, poseen un complejo ojo tipo cámara con múltiples capas de tejido pigmentado y se sabe que producen melanosomas (en el saco de tinta). Hemos caracterizado sistemáticamente la localización anatómica y la química de los tejidos pigmentados, así como la geometría de los gránulos de pigmento, en los ojos del pulpo común (Octopus vulgaris), el calamar europeo (Loligo vulgaris), la sepia común (Sepia officianalis), la lamprea de mar (Petromyzon marinus) y la lubina europea (Dicentrachus labrax), junto con datos procedentes de fósiles (material suplementario electrónico, tabla S1). Los tejidos se analizaron mediante tinción histológica de Warthin-Starry, oxidación con peróxido de hidrógeno alcalino (AHPO ) y microscopía electrónica de barrido (SEM). En los ojos de los vertebrados existentes, la melanina reduce el estrés oxidativo mediante la quelación de iones metálicos y trabajos recientes muestran que los melanosomas de los vertebrados tienen una química de oligoelementos específica para cada tejido. Por lo tanto, hemos comprobado si la química de los oligoelementos puede discriminar los melanosomas de los ojos de los vertebrados y de los cefalópodos utilizando el escaneo rápido de sincrotrón y la fluorescencia de rayos X (SRS-XRF) y la espectroscopia de absorción de rayos X cerca del borde (XANES).

Figura 1. Anatomía de los ojos de cefalópodos y vertebrados existentes. Ilustraciones esquemáticas de (a) el ojo de un cefalópodo y (b) el ojo de un vertebrado con, en el recuadro, detalles de las capas de tejido. (c) Secciones histológicas y micrografías electrónicas de barrido (SEM) de ojos de Loligo, Octopus, Sepia y Petromyzon. Las secciones están teñidas con Warthin-Starry; la melanina aparece en negro. Todos los tejidos muestran microcuerpos similares a los de los melanosomas. C, coroides; I/flechas negras, iris; L, cristalino; O, nervio óptico; OG, ganglios del nervio óptico; R, retina; RPE/*, epitelio pigmentario de la retina; RPL/flechas, capa pigmentada de la retina; S/flecha blanca, esclera; SCL, capa subciliar; V, humor vítreo. (Versión online en color.)

Material y métodos

(a) Especímenes modernos y fósiles

Los especímenes de Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon y Dicentrachus (cada uno n = 5) se obtuvieron de proveedores comerciales (Ballycotton Seafoods y K O’Connell Fish Merchants (English Market en Cork, República de Irlanda) y Online Baits UK). Las lampreas se suministraron congeladas y se diseccionaron inmediatamente después de descongelarlas; los cefalópodos y la lubina europea estaban muertos en el momento de la compra y se diseccionaron en las 24 horas siguientes a su muerte. Los ojos se fijaron en glutaraldehído al 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente, se deshidrataron en etanol y se almacenaron en etanol al 70% antes de los análisis posteriores.

Este estudio incluye el análisis de los ojos de los siguientes ocho fósiles: de Mazon Creek, dos especímenes de Tullimonstrum (CKGM F 6426 y FMNH PE 22061), un espécimen de cada uno de los vertebrados Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) y Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) y el único espécimen del cefalópodo fósil Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); de Green River (Eoceno, Colorado/Utah/Wyoming), un ejemplar de Knightia sp. (FOBU 17591) y de la Formación Fur (Eoceno, Dinamarca) un Teterodontiformes indeterminado (NHMD 199838); de la Hâkel and Hâdjoula Lagerstätte (Cretácico Superior, Líbano), el pulpo fósil Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Abreviaturas institucionales: NHMUK, Museo de Historia Natural de Londres; NHMD, Museo de Historia Natural de Dinamarca; FMNH, Museo Field de Historia Natural; CKGM, Museo Geológico de Cork; FOBU, Monumento Nacional Fossil Butte.

(b) Oxidación con peróxido de hidróxido alcalino e hidrólisis con ácido hidródico

Los tejidos se diseccionaron utilizando herramientas estériles, se colocaron en viales de vidrio, se liofilizaron y se pulverizaron. La coroides de los vertebrados y el EPR no pudieron separarse, por lo que se trataron como un único tejido en este análisis. Las muestras de tejido liofilizado (9-17 mg) se homogeneizaron en agua con un homogeneizador Ten-Broeck a una concentración de 10 mg ml-1 y se procesaron alícuotas de 100 µl o 200 µl mediante AHPO e hidrólisis de ácido yodado . El AHPO después de la hidrólisis de HCl comprueba la presencia de ácido pirrol-2,3,5-tricarboxílico (un marcador de eumelanina ); el análisis con ácido hidroyódico comprueba la presencia de 4-amino-3-hidroxifenilalanina (un marcador de feomelanina ).

(c) Histología

Muestras disecadas de tejidos de ojos de cefalópodos y de coroides, iris, EPR y esclera de ojos de vertebrados se fijaron utilizando glutaraldehído al 2,5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de tejido fijadas se procesaron para la histología y se tiñeron utilizando el protocolo de Warthin-Starry, que comprueba la presencia de melanina.

(d) Microscopía electrónica de barrido

Se secaron pequeñas muestras (aproximadamente 1-2 mm2) de tejido ocular utilizando hexametildisilazano o nitrógeno líquido. Las muestras de tejido secadas y las secciones finas descubiertas se montaron en soportes de aluminio, se recubrieron con oro/paladio y se obtuvieron imágenes a una tensión de aceleración de 5-15 keV utilizando un SEM FEI Quanta 650 y un SEM Zeiss Gemini Supra 40. Los análisis de espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (EDS) se llevaron a cabo utilizando un VP-SEM Hitachi S-3500N equipado con un espectrómetro de energía dispersiva EDAX Genesis a una tensión de aceleración de 15 kV con tiempos de adquisición de 120 s para los mapas EDS (material suplementario electrónico, figura S1).

(e) Análisis de la geometría y el tamaño de los melanosomas

Se midieron los datos de geometría de al menos 20 melanosomas (y, en su caso, de los microcuerpos similares a los melanosomas) para cada tejido de cada espécimen. Las diferencias en la geometría se probaron utilizando ANOVA o (cuando los datos son heteroscedásticos) la prueba F de Welch junto con un análisis post hoc por pares en PAST (Tukey para ANOVA y Dunn para los análisis de la prueba F de Welch, respectivamente) . Los datos de la geometría del melanosoma de S. officianalis son homocedásticos pero no normales y por lo tanto se analizaron después de la transformación logarítmica.

(f) Fluorescencia de rayos X de barrido rápido de sincrotrón

Las mediciones se llevaron a cabo en las líneas de haz 2-3 y 10-2 en el Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). La energía de rayos X incidente se fijó en 11 keV utilizando un monocromador de doble cristal de Si (111) con el anillo de almacenamiento conteniendo 500 mA en modo top-off a 3,0 GeV. En la línea de haz 2-3, se proporcionó un haz microfocalizado de 2 × 2 µm mediante un par de espejos Kirkpatrick-Baez recubiertos de Rh, mientras que en la línea de haz 10-2 se utilizaron aberturas de tungsteno para lograr tamaños de haz seleccionables entre 25 y 200 µm. La intensidad de los rayos X incidentes en cada línea de luz se midió con una cámara de iones llena de nitrógeno. Las muestras se montaron a 45° con respecto al haz de rayos X incidente y se rastrearon espacialmente durante un tiempo de permanencia de 20-50 ms pixel-1. En la línea de luz 2-3 se cartografiaron las siguientes muestras: secciones finas sin cubrir y sin teñir de los ojos de un individuo de Dicentrachus y Octopus y de dos individuos de Loligo y Petromyzon; las cuencas oculares de un espécimen de Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. y los Teterodontiformes indet. En la línea de luz 10-2 se mapearon: el segundo espécimen de Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia y muestras de tejidos blandos de Keuppia sp. Las dos líneas de luz diferentes se utilizaron para acomodar muestras/especimenes de diferentes tamaños (los especímenes demasiado grandes para la etapa de muestreo en la línea de luz 2-3 se acomodaron en la 10-2). Los datos de los fósiles de cada línea de luz se calibraron con el mismo conjunto de estándares y, por tanto, las variaciones en los datos son reales y no reflejan variaciones en los parámetros analíticos. Se recogió todo el espectro de fluorescencia en cada punto de datos y se controló la intensidad de las líneas de fluorescencia de los elementos seleccionados (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu y Zn) utilizando un detector Vortex de deriva de silicio (Hitachi, EE.UU.) acoplado a un sistema de procesamiento de pulsos Xpsress3 (Quantum Detectors) para la discriminación energética. Las intensidades de fluorescencia se corrigieron en función del tiempo muerto del detector y se normalizaron con respecto al flujo entrante (I0STRM). Las concentraciones de cada elemento en µg cm-2 se calibraron utilizando estándares elementales de película fina trazables del NIST. El procesamiento de los datos se realizó con el software MicroAnalysis Toolkit . Se calcularon los valores de la media y la desviación estándar para las concentraciones de cada elemento en las regiones de interés seleccionadas. Las diferencias en las concentraciones elementales entre las regiones de interés se evaluaron utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) en PAST . Los datos se agruparon utilizando un único nivel de clasificación correspondiente al tejido de origen, por ejemplo, capa pigmentada de la retina del pulpo (RPL), iris del Petromyzon, esclerótica del Petromyzon, mancha ocular del FMNH PE 22061, etc. El análisis de componentes principales de los datos produce una distribución de los datos que es casi idéntica a la del LDA (material suplementario electrónico, figura S4a,b).

(g) Espectroscopia de absorción de rayos X cerca de la estructura de borde

XANES se recogieron en la línea de haz 2-3 en el SSRL a partir de puntos de interés identificados en los mapas XRF. Esto se consiguió conduciendo la energía del haz incidente a través del borde K del Cu de forma escalonada y registrando la intensidad emitida de la línea Kα en función de la energía incidente . La calibración de la energía del monocromador se logró utilizando una lámina de Cu. Los espectros XANES se obtuvieron de la RPL y la esclerótica de Loligo, la coroides de Petromyzon y de las manchas oculares del espécimen de Tetradontiformes indet., Knightia y Tullimonstrum (CKGM F 6426). Los espectros se procesaron utilizando el paquete de software Athena.

Resultados

(a) Melanina y melanosomas en ojos de cefalópodos y vertebrados existentes

Inesperadamente, varias capas de tejido distintas en los ojos de todos los cefalópodos estudiados muestran tinción negra, específica de melanina (figura 1). Estos datos están respaldados por los análisis de AHPO, que confirman que los tejidos teñidos de Loligo, Octopus y Sepia son ricos en eumelanina y, en menor medida, en feomelanina (material suplementario electrónico, tabla S2). El análisis SEM de los tejidos ricos en melanina confirma la presencia de microcuerpos esferoides/alargados (ver también ; figura 1). Es muy poco probable que los microcuerpos representen bacterias de la caries, ya que los primeros aparecen dentro de los ojos intactos de los especímenes recién sacrificados sin evidencia de daño tisular, muestran una estratificación consistente de tamaño específico entre los especímenes del mismo taxón y son estables bajo el haz de electrones. Además, es poco probable que los microcuerpos representen gránulos de ommocromo, ya que los primeros aparecen en capas de tejido que se tiñen positivamente para la melanina en la sección histológica y contienen marcadores de diagnóstico para la eumelanina en los análisis de AHPO. No hay otros microcuerpos que puedan generar estos resultados. Los microcuerpos en las capas de tejido que se tiñen de negro en las secciones histológicas de los ojos de los cefalópodos se interpretan, por tanto, de forma más plausible como melanosomas.

En los cefalópodos existentes, los melanosomas se encuentran en el iris y en capas de tejido adicionales situadas en la parte posterior del ojo (definida aquí como la RPL) y detrás del iris (definida aquí como la capa subciliar (SCL); figura 1a,c). Todos los cefalópodos estudiados poseen una SCL, pero sólo se pudieron obtener muestras de calidad histológica de este tejido en el caso de Octopus. Los melanosomas difieren significativamente en su geometría entre el iris y el RPL tanto en Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3) como en Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (figura 2a,c). Las diferencias en la geometría de los melanosomas oculares de Octopus y Petromyzon son estadísticamente significativas para algunas poblaciones de melanosomas, pero no todas (figura 2b,d; material suplementario electrónico, tabla S4). Además de los melanosomas, la retina de los cefalópodos contiene abundantes gránulos subangulares de forma irregular (figura 1c). Esta geometría es inconsistente con la de los melanosomas conocidos en vertebrados y cefalópodos; los gránulos pueden, por tanto, representar ommatinas u otros pigmentos fotosensibles, pero su identidad está aún por demostrar químicamente. Varios tejidos del ojo de la lamprea y de la lubina se tiñen de eu- y phaeomelanina (figura 1b,c); el análisis AHPO confirma la presencia de melanina en estos tejidos y demuestra una marcada variación en las concentraciones de eumelanina entre los ojos de los dos vertebrados (material suplementario electrónico, tabla S2).

Figura 2. Geometría de los melanosomas oculares. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia y (d) Petromyzon.

En resumen, nuestros datos revelan que los melanosomas de los diferentes tejidos del ojo tienen geometrías significativamente diferentes tanto en los cefalópodos como en los vertebrados existentes (material suplementario electrónico, tablas S3 y S4; figura 2).

(b) Química de los melanosomas oculares

Utilizamos SRS-XRF y XANES para comprobar si la química de los metales traza puede distinguir los melanosomas oculares de los vertebrados de los cefalópodos. En los ojos de los calamares y pulpos existentes, sólo el Cu muestra una partición espacial llamativa (figura 3a,b): está enriquecido en la esclerótica pero no en el RPL rico en melanina (u otros tejidos). El Zn muestra una partición sutil en ambos taxones de cefalópodos analizados: está ligeramente enriquecido en el RPL del pulpo y, en menor medida, en la esclera del calamar. En los vertebrados, sin embargo, los tejidos portadores de melanosomas muestran una llamativa partición de Zn (y, en la lamprea, de Fe y Cu) (figura 3c,d). En la lamprea, el Fe está enriquecido en el iris; el Zn está enriquecido en el iris y, especialmente, en la coroides y el EPR, y el Cu está enriquecido en todos los tejidos con melanosomas. En la lubina, el Zn está enriquecido en todos los tejidos con melanosomas. En los mapas de FRX de los ojos de los vertebrados existentes, la coroides y el EPR no pueden discriminarse mediante la química de los oligoelementos o la ultraestructura, lo que obliga a tratarlos como un único tejido. No consideramos que esto afecte a nuestros resultados principales, ya que nuestros datos de cefalópodos y otros tejidos oculares de vertebrados muestran que la variación química intraespecífica es menor en relación con la variación interespecífica (figura 4a,b). Los tejidos ricos en melanosomas de los ojos de los vertebrados existentes, pero no de los cefalópodos, están por tanto enriquecidos en Zn (y a veces en Fe y Cu) en relación con otros tejidos oculares.

Figura 3. Análisis SRS-XRF de secciones histológicas de Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) y Dicentrachus (d), y de vertebrados fósiles (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) y Knightia (f), cefalópodo fósil Keuppia (g) y Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Las secciones histológicas están teñidas con Warthin-Starry; la melanina aparece en negro. Los mapas de SRS-XRF en (a-h) son de regiones mostradas en secciones histológicas y fotografías. Véase en el material suplementario electrónico, figura S2, la localización de las regiones en las fotografías de las secciones histológicas y la localización de las regiones en las fotografías de los fósiles mostrados. Flechas negras, iris; puntas de flecha, RPL; asterisco, RPE; flechas blancas, esclerótica. Los valores máximos de concentración para cada mapa SRS-XRF se proporcionan en el material suplementario electrónico, tabla S5. (Versión online en color.)

Figura 4. Química de elementos traza de cefalópodos y vertebrados existentes y fósiles y Tullimonstrum. (a) LDA basado en las concentraciones medidas de Ti, Fe, Cu y Zn. (b) Biplot de los elementos clave que contribuyen a la variación en (a). (c) Espectros XANES de especímenes seleccionados y estándares en el borde K del Cu (línea discontinua a 8987 eV). La mayor variación química entre Tullimonstrum y otros fósiles de Mazon Creek presente en (a) en relación con la variación entre otras biotas fósiles está presente incluso cuando se elimina el Fe del conjunto de datos (material suplementario electrónico, figura S4c,d). Las puntas de flecha en (c) indican la posición de los rasgos de preborde en estos espectros. Los datos de la bolsa de tinta del calamar fósil son de .

Para comprobar si esta señal persiste en los fósiles, analizamos las manchas oculares en dos cefalópodos fósiles y cuatro vertebrados fósiles. A excepción del cefalópodo Pohlsepia de Mazon Creek, las manchas oculares de todos los especímenes contienen microcuerpos similares a los del melanosoma (material suplementario electrónico, figura S3). Los mapas de SRS-XRF muestran que las manchas oculares de los vertebrados fósiles Knightia y Tetradontiformes indet. (figura 3e-f) están enriquecidas en Ti y Cu en relación con la matriz sedimentaria, con un enriquecimiento menor de Zn en esta última. Por el contrario, la mancha ocular de Keuppia está relativamente enriquecida sólo en Ti, Fe y Zn (figura 3g). La mancha ocular de Tullimonstrum está enriquecida en Ti, Fe, Cu y Zn en relación con los tejidos blandos circundantes (figura 3h). Estos datos químicos no son totalmente consistentes con la señal en los cefalópodos fósiles estudiados o los vertebrados fósiles.

Utilizamos LDA para explorar la variación en las concentraciones de los elementos clave Ti, Fe, Cu y Zn en nuestro conjunto de datos. Los tejidos oculares de los vertebrados existentes y de los cefalópodos se trazan en regiones separadas del quimioespacio y por separado de sus homólogos fósiles (figura 4a,b). La química de los elementos traza de las manchas oculares de los vertebrados inequívocos de la cala de Mazón es distinta de la de los dos especímenes de Tullimonstrum, que se trazan juntos. La separación de los vertebrados inequívocos del arroyo Mazón de Tullimonstrum a lo largo del eje LD2 refleja el enriquecimiento de los primeros en Zn y, en menor medida, en Cu y Fe: curiosamente, esto refleja la variación en la química entre los vertebrados existentes y los cefalópodos. Las manchas oculares de Tullimonstrum son, sin embargo, químicamente distintas de las de Pohlsepia, un cefalópodo inequívoco del arroyo Mazón.

Exploramos la variación en el estado de oxidación del Cu, un metal comúnmente asociado con la melanina, en taxones seleccionados, fósiles y modernos, utilizando XANES. Los espectros XANES en el borde K del Cu tomados de la coroides de la lamprea y de dos manchas oculares de vertebrados fósiles muestran todos ellos picos de absorción centrados en 8994 ± 1 eV, indicando fuertes contribuciones del Cu(II) (figura 4c). Los espectros del RPL del calamar (melanizado) y de la esclerótica (no melanizada) se parecen mucho a los de los vertebrados, pero muestran características de preborde en 8978,59 eV y 8977,58 eV, respectivamente, cuyas posiciones revelan la presencia de Cu(I) . En el espectro de Keuppia aparece una característica de preborde que abarca los 8976,73-8984,27 eV, que también refleja una contribución de Cu(I). La presencia de Cu(I) en los espectros XANES de cefalópodos existentes y fósiles podría reflejar la reducción del Cu(II) durante el análisis. Las muestras de vertebrados, sin embargo, no muestran ninguna contribución de Cu(I) a pesar de haber sido analizadas en condiciones experimentales idénticas (los espectros de algunas muestras de vertebrados (por ejemplo, Knightia) muestran rasgos de preborde muy débiles, pero estos son menos fáciles de interpretar como evidencia inequívoca de Cu(I)). Alternativamente, las contribuciones de Cu(I) en los tejidos oculares de los cefalópodos podrían derivar de la hemocianina desoxigenada, la molécula respiratoria de los cefalópodos. El espectro XANES de Tullimonstrum muestra un pico dominante a 8994,38 eV y una característica prominente de preborde a 8987,8-8990,2 eV. Estas características son consistentes con las contribuciones de múltiples estados de oxidación del Cu, incluyendo una clara contribución del Cu(I), como en los cefalópodos existentes y fósiles.

Discusión

Nuestro estudio revela que los ojos de los cefalópodos existentes poseen melanosomas con geometrías específicas de los tejidos. El colapso del ojo del cefalópodo durante la descomposición podría generar potencialmente capas de melanosomas de tamaño específico, superficialmente similares a las del EPR de los vertebrados (figura 1a,b). La presencia de melanosomas con tamaños y/o geometrías específicas de los tejidos en los ojos de los cefalópodos existentes (figura 2a,c) indica, por tanto, que las sucesivas capas de melanosomas de diferentes tamaños y/o geometrías en los fósiles no pueden interpretarse automáticamente como evidencia del EPR de los vertebrados. Se desconoce hasta qué punto otros grupos de invertebrados fósiles conservan melanosomas oculares (pero véase Lindgren et al. para la evidencia química de la melanina en los ojos de los insectos fósiles).

La melanina en los ojos de los vertebrados existentes puede unir varios elementos, cuya abundancia relativa puede variar con factores biológicos y ambientales . En los vertebrados, la melanina puede secuestrar iones metálicos, previniendo potencialmente el daño oxidativo de los tejidos . En comparación con los vertebrados, los ojos de los cefalópodos muestran bajas concentraciones de metales en los tejidos melanizados (figura 3a,b). Esto probablemente refleja la relativamente baja abundancia de melanina (material suplementario electrónico, tabla S2) y sugiere que las vías no relacionadas con la melanina son responsables de prevenir el daño tisular por la exposición a los iones metálicos en los cefalópodos, es decir, la función de la melanina en los ojos de los cefalópodos difiere de la de los vertebrados. La variación en el contenido de melanina en los ojos de los vertebrados existentes (material suplementario electrónico, tabla S2) podría reflejar variaciones en la ecología y/o en el hábitat de la luz.

Nuestros datos químicos sobre los vertebrados existentes y los cefalópodos muestran que la variación entre clados es notablemente mayor que dentro de cualquiera de los grupos (figura 3a-d). Los tejidos melanizados de los ojos de los vertebrados existentes están enriquecidos en Zn (figura 4a,b) y muestran una fuerte señal de Cu(II) en los espectros XANES (figura 4c); en cambio, los tejidos melanizados de los cefalópodos existentes son bajos en Zn y muestran una contribución mixta de Cu(I) y Cu(II). Del mismo modo, los melanosomas oculares en Tullimonstrum son bajos en Zn en relación con los de los vertebrados de Mazon Creek y los espectros XANES indican la presencia de Cu(I). Las manchas oculares de Pohlsepia, sin embargo, no coinciden con las de Tullimonstrum ni con las de los vertebrados de Mazon Creek en el quimioespacio LDA. La química de los vertebrados y cefalópodos inequívocos del arroyo Mazón no se ajusta, pues, al patrón general de enriquecimiento de elementos en los cefalópodos y vertebrados modernos. En conjunto, los datos sobre la morfología y la química de los melanosomas no son del todo coherentes con una afinidad de los vertebrados por Tullimonstrum. Una afinidad invertebrada no puede excluirse, pero una afinidad de cefalópodo es inverosímil, dado la ausencia de otros caracteres morfológicos diagnósticos.

La estructura química de la melanina es conocida para ser alterada por los cambios en el pH y la exposición a las concentraciones elevadas de metal, las presiones y las temperaturas, todos los cuales son comúnmente experimentados durante la diagénesis. Por lo tanto, es probable que los melanosomas de diferentes taxones fósiles del mismo o de diferentes biotas puedan seguir diferentes vías diagenéticas, dando lugar a químicas de elementos traza dispares (como es evidente en los estudios de la geoquímica orgánica de las melaninas fósiles). La variación química entre los fósiles observada aquí (figura 3e-h) presumiblemente refleja la variación en la litología del huésped y/o la historia diagenética. Por ejemplo, la ausencia de melanosomas preservados en Pohlsepia sugiere que este espécimen experimentó una alteración más extensa durante la diagénesis que los otros especímenes fósiles analizados. Además, la variación en la química de los elementos traza entre los fósiles de Mazon Creek es mayor que para los fósiles de todas las demás biotas. Esto sugiere que la diagénesis química de los melanosomas en los fósiles de Mazon Creek es más variable que la de otras biotas, lo que impide una interpretación concluyente de la química original de los elementos traza. No obstante, los ojos de Knightia y el espécimen de Tetradontiformes indet. tienen firmas de metales traza similares a pesar de proceder de biotas diferentes y, por tanto, presumiblemente tener historias diagenéticas distintas. Los estudios futuros que se centren en la respuesta de la química de los elementos traza del melanosoma a varios factores diagenéticos, por ejemplo, el pH, la litología, la presión y la temperatura, serán fundamentales para discriminar la química original de los productos químicos de la diagénesis.

Accesibilidad a los datos

Proporcionamos todos los datos en el texto principal, en el material suplementario electrónico o a través del Repositorio Digital Dryad: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Contribuciones de los autores

C.S.R. y T.I.A. realizaron la histología; C.S.R., T.I.A. y M.E.M. realizaron la SEM; C.S.R., M.E.M. y S.M.W. realizaron la exploración rápida de sincrotrón-fluorescencia de rayos X y la espectroscopia de absorción de rayos X (XAS); S.I. y K.W. realizaron los análisis de AHPO; C.S.R. y M.E.M. redactaron el manuscrito con la aportación de todos los demás autores.

Intereses en competencia

Los autores declaran no tener intereses en competencia.

Financiación

Apoyada por European Research Starting Grant (subvención nº ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) concedida a M.E.M. El uso del Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, está apoyado por el US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences bajo contrato nº. DE-AC02-76SF00515.

Agradecimientos

Damos las gracias a A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson y A. Stroup por el acceso a las muestras; a N. Edwards por el apoyo de XAS; a V. Rossi y R. Wogelius para la discusión.

Notas a pie de página

El material complementario electrónico está disponible en línea en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. All rights reserved.

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