Synkrotron røntgenabsorptionsspektroskopi af melanosomer i hvirveldyr og blæksprutter: implikationer for affiniteten af Tullimonstrum

Introduktion

Screening pigmenter er en væsentlig komponent af visuelle systemer i dyr, da de absorberer vildfarende lys, hvilket giver mulighed for retningsbestemt fotoreception og beskyttelse af fotoreceptorer fra ultraviolet stråling . Screeningspigmenter hos hvirvelløse dyr omfatter ommochromer, pteriner og, sjældnere, melanin . I modsætning hertil er det primære screeningpigment hos hvirveldyr melanin, der forekommer som melanosomer (membranbundne organeller) i iris, choroid, retinalpigmenteret epithel (RPE) og sclera (figur 1). RPE-melanosomer omfatter sfæriske og aflange former, der er rumligt opdelt . I stærkt indfaldende lys vandrer de aflange melanosomer til de apikale processer af RPE-cellerne og beskytter således de lysfølsomme pigmenter i fotoreceptorcellerne mod blegning. Det er interessant, at øjnene hos den gådefulde taxon Tullimonstrum gregarium (Karbon, Mazon Creek, IL, USA) også udviser på hinanden følgende lag af melanosomer af forskellig geometri. Dette træk blev fortolket som bevis for en affinitet med hvirveldyr baseret på en gennemgang af melanosomfordelingen og -morfologien hos nulevende dyr . Det er imidlertid uvist, om hvirvelløse dyrs øjenmelanosomer er organiseret i på hinanden følgende vævslag som hos hvirveldyr. For at løse dette kræves en systematisk undersøgelse af screeningspigmenter i hvirvelløse dyrs øjne. Blæksprutter er et ideelt forsøgsdyr, fordi de ligesom hvirveldyr har et komplekst kameraøjne med flere pigmenterede vævslag og er kendt for at producere melanosomer (i blæksækken ). Vi har systematisk karakteriseret den anatomiske placering og kemien af pigmentvæv og pigmentgranulernes geometri i øjnene hos blæksprutte (Octopus vulgaris), europæisk blæksprutte (Loligo vulgaris), almindelig blæksprutte (Sepia officianalis), havlampret (Petromyzon marinus) og europæisk aborre (Dicentrachus labrax), koblet med data fra fossiler (elektronisk supplerende materiale, tabel S1). Vævene blev analyseret ved hjælp af Warthin-Starry histologisk farvning, alkalisk hydrogenperoxidoxidoxidation (AHPO ) og scanningelektronmikroskopi (SEM). I øjnene af uddøde hvirveldyr reducerer melanin oxidativ stress ved at chelatere metalioner, og nyere arbejde viser, at hvirveldyrs melanosomer har vævsspecifikke sporelementkemier . Vi testede derfor, om sporstofkemi kan skelne mellem hvirveldyrs og blæksprutternes øjenmelanosomer ved hjælp af synkrotron hurtig scanning-X-ray fluorescens (SRS-XRF) og XANES-spektroskopi (XANES).

Figur 1. Anatomi af eksistente blæksprutte- og hvirveldyrøjne. Skematiske illustrationer af (a) blæksprutteøje og (b) hvirveldyrsøje med detaljer af vævslagene i indsnittet. (c) Histologiske snit og scanningelektronmikrografer (SEM) af øjne hos Loligo, Octopus, Sepia og Petromyzon. Sektionerne er farvet med Warthin-Starry; melanin fremstår sort. Alle væv viser melanosom-lignende mikroorganer. C, choroid; I/sorte pile, iris; L, linse; O, synsnerve; OG, synsnerveganglier; R, nethinde; RPE/*, retinalt pigmentepithel; RPL/pilspidser, retinalt pigmenteret lag; S/hvid pil, sclera; SCL, subciliært lag; V, glaslegeme. (Online-version i farver.)

Materiale og metoder

(a) Moderne og fossile eksemplarer

Eksemplarer af Octopus, Sepia, Loligo, Petromyzon og Dicentrachus (hver n = 5) blev indhentet fra kommercielle leverandører (Ballycotton Seafoods og K O’Connell Fish Merchants (English Market i Cork, Republikken Irland) og Online Baits UK). Lampretterne blev leveret frosset og dissekeret straks efter optøning; blæksprutterne og aborrerne var døde på købstidspunktet og blev dissekeret inden for 24 timer efter døden. Øjnene blev fikseret i 2,5 % glutaraldehyd i 1 time ved stuetemperatur, dehydreret i ethanol og opbevaret i 70 % ethanol inden yderligere analyse.

Denne undersøgelse omfatter analyse af øjenpotte af følgende otte fossiler: fra Mazon Creek, to eksemplarer af Tullimonstrum (CKGM F 6426 og FMNH PE 22061), et eksemplar af hvirveldyrene Mayomyzon peickoensis (FMNH PF 5688) og Gilpichthys greenei (FMNH PF 8474) og det eneste eksemplar af den fossile cephalopode Pohlsepia mazonensis (FMNH PE 51727); fra Green River (Eocæn, Colorado/Utah/Wyoming), et eksemplar af Knightia sp. (FOBU 17591) og fra Fur-formationen (Eocæn, Danmark) en ubestemt Teterodontiformes (NHMD 199838); fra Hâkel og Hâdjoula Lagerstätte (sen kridttid, Libanon), den fossile blæksprutte Keuppia sp. (NHMUK PICC651A). Institutionelle forkortelser: NHMUK, Natural History Museum London; NHMD, Danmarks Naturhistoriske Museum; FMNH, Field Museum of Natural History; CKGM, Cork Geological Museum; FOBU, Fossil Butte National Monument.

(b) Alkalisk hydroxidperoxidoxidoxidation og hydrolyse med jodsyre

Tvæv blev dissekeret ved hjælp af sterilt værktøj, anbragt i glasflasker, frysetørret og pulveriseret. Hvirveldyrs choroid og RPE kunne ikke adskilles og blev derfor behandlet som et enkelt væv i denne analyse. Frysetørrede vævsprøver (9-17 mg) blev homogeniseret i vand med en Ten-Broeck-homogenisator ved en koncentration på 10 mg ml-1 , og alikvotes på 100 µl eller 200 µl blev behandlet ved hjælp af AHPO og hydrolyse med jodsyre . AHPO efter HCl-hydrolyse tester for tilstedeværelsen af pyrrol-2,3,5-tricarboxylsyre (en markør for eumelanin ); jodhydroxysyreanalyse tester for tilstedeværelsen af 4-amino-3-hydroxylphenylalanin (en markør for phaeomelanin ).

(c) Histologi

Dissekterede vævsprøver fra blæksprutteøjne og choroid, iris, RPE og sclera fra hvirveldyrøjne blev fikseret med 2,5 % glutaraldehyd i 1 time ved stuetemperatur. De fikserede vævsprøver blev behandlet til histologi og farvet efter Warthin-Starry-protokollen, som tester for tilstedeværelsen af melanin.

(d) Scanningelektronmikroskopi

Små prøver (ca. 1-2 mm2) af øjenvæv blev tørret ved hjælp af hexamethyldisilazan eller flydende nitrogen. Tørrede vævsprøver og tynde sektioner, der ikke var dækket, blev monteret på aluminiumstubbe, sputterbelagt med guld/palladium og afbildet ved en accelerationsspænding på 5-15 keV ved hjælp af et FEI Quanta 650 SEM og et Zeiss Gemini Supra 40 SEM. Energidispersive røntgenspektroskopi (EDS) analyser blev udført ved hjælp af et Hitachi S-3500N VP-SEM udstyret med et EDAX Genesis energidispersivt spektrometer ved en accelerationsspænding på 15 kV med optagelsestider på 120 s for EDS-kort (elektronisk supplerende materiale, figur S1).

(e) Analyse af melanosomgeometri og -størrelse

Geometridata blev målt for mindst 20 melanosomer (og, hvor det var relevant, melanosomlignende mikroorganer) for hvert væv i hvert enkelt eksemplar. Forskelle i geometri blev testet ved hjælp af ANOVA eller (hvor dataene er heteroscedastiske) Welch’s F-test kombineret med parvis post hoc-analyse i PAST (Tukey for ANOVA-analyser og Dunn for Welch’s F-test-analyser, henholdsvis) . Melanosomgeometridata for S. officianalis er homoscedastiske, men ikke-normale og blev derfor analyseret efter log-transformation.

(f) Synkrotron hurtigscanning af røntgenfluorescens

Målinger blev udført på beamlines 2-3 og 10-2 på Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL). Den indfaldende røntgenenergi blev indstillet til 11 keV ved hjælp af en Si(111)-dobbeltkrystalmonokromator med en lagringsring med 500 mA i top-off-tilstand ved 3,0 GeV. På stråle linje 2-3 blev en mikrofokuseret stråle på 2 × 2 µm leveret af et Rh-belagt Kirkpatrick-Baez-spejlpar, mens stråle linje 10-2 anvendte wolfram-aperturer for at opnå valgbare strålestørrelser mellem 25 og 200 µm. Den indfaldende røntgenintensitet ved hvert stråleområde blev målt med et nitrogenfyldt ionkammer. Prøverne blev monteret i en vinkel på 45° i forhold til den indfaldende røntgenstråle og blev rumligt rasteret i en opholdstid på 20-50 ms pixel-1. Følgende blev kortlagt ved stråleklinik 2-3: uoverskårne og ufarvede tyndsnit af øjne fra et individ af Dicentrachus og Octopus og fra to individer af Loligo og Petromyzon; øjenpletterne fra et eksemplar af Tullimonstrum (CKGM F 6426), Knightia sp. og Teterodontiformes indet. Følgende blev kortlagt på beamline 10-2: det andet eksemplar af Tullimonstrum (FMNH PE 22061), Mayomyzon, Gilpichthys, Pohlsepia og prøver af blødt væv fra Keuppia sp. De to forskellige beamlines blev brugt til at rumme prøver/eksemplarer af forskellig størrelse (eksemplarer, der var for store til prøvetagningen på beamline 2-3, blev rummet på 10-2). De fossile data fra hver beamline blev kalibreret i forhold til det samme sæt standarder, og derfor er variationer i dataene reelle og afspejler ikke variationer i analyseparametre. Hele fluorescensspektret blev indsamlet ved hvert datapunkt, og intensiteten af fluorescenslinjerne for udvalgte grundstoffer (P, S, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu og Zn) blev overvåget ved hjælp af en siliciumdrift Vortex-detektor (Hitachi, USA) koblet til et Xpsress3-impulsbehandlingssystem (Quantum Detectors) til energidiskriminering. Fluorescensintensiteterne blev korrigeret for detektorens dødtid og normaliseret i forhold til den indgående flux (I0STRM). Koncentrationerne af hvert element i µg cm-2 blev kalibreret ved hjælp af NIST-sporbare tyndfilm-elementstandarder. Databehandlingen blev udført ved hjælp af MicroAnalysis Toolkit-softwaren . Middel- og standardafvigelsesværdierne blev beregnet for koncentrationerne af hvert element i udvalgte områder af interesse. Forskelle i elementkoncentrationer mellem interesseområder blev vurderet ved hjælp af lineær diskriminantanalyse (LDA) i PAST . Dataene blev grupperet ved hjælp af et enkelt klassifikationsniveau svarende til oprindelsesvævet, f.eks. blæksprutte med retinal pigmenteret lag (RPL), Petromyzon iris, Petromyzon sclera, FMNH PE 22061 eyespot osv. Hovedkomponentanalyse af dataene giver en fordeling af dataene, der er næsten identisk med LDA (elektronisk supplerende materiale, figur S4a,b).

(g) Røntgenabsorption nær kantstrukturspektroskopi

XANES-spektre blev indsamlet ved beamline 2-3 på SSRL fra interessepunkter, der er identificeret i XRF-kortene. Dette blev opnået ved at drive den indfaldende stråleenergi gennem Cu K-kanten trinvis og registrere den udsendte intensitet af Kα-linjen som en funktion af den indfaldende energi . Kalibreringen af monokromatorens energi blev foretaget ved hjælp af en Cu-folie. XANES-spektre blev opnået fra Loligos RPL og sclera, Petromyzons choroid og fra øjenpletter i et eksemplar af Tetradontiformes indet., Knightia og Tullimonstrum (CKGM F 6426). Spektre blev behandlet ved hjælp af softwarepakken Athena .

Resultater

(a) Melanin og melanosomer i uddøde blæksprutte- og hvirveldyrøjne

Uventuelt viser flere forskellige vævslag i øjnene hos alle de undersøgte blæksprutter sort, melanin-specifik farvning (figur 1). Disse data understøttes af AHPO-analyser, som bekræfter, at de farvede væv hos Loligo, Octopus og Sepia er rige på eumelanin og i mindre grad på phaeomelanin (elektronisk supplerende materiale, tabel S2). SEM-analyse af de melaninrige væv bekræfter tilstedeværelsen af sfæroide/oblange mikroorganer (se også ; figur 1). Det er højst usandsynligt, at mikroorganerne repræsenterer forrådnelsesbakterier, da de førstnævnte forekommer i de intakte øjne af nyligt dræbte eksemplarer uden tegn på vævsskader, viser konsekvent størrelsesspecifik lagdeling blandt eksemplarer af samme taxon og er stabile under elektronstrålen. Endvidere er det usandsynligt, at mikrostofferne repræsenterer ommochromgranuler, da de forekommer i vævslag, der i histologiske snit er farvet positivt for melanin og indeholder diagnostiske markører for eumelanin i AHPO-analyser. Der findes ingen andre mikroorganer, som kunne give disse resultater. Mikrostofferne i de vævslag, der farves sort i histologiske snit af blæksprutteøjne, tolkes derfor mest plausibelt som melanosomer.

I eksisterende blæksprutter forekommer melanosomer i iris og i yderligere vævslag, der er placeret på bagsiden af øjet (her defineret som RPL) og bag iris (her defineret som det subciliære lag (SCL); figur 1a,c). Alle de undersøgte blæksprutter har et SCL, men det var kun for blæksprutterne muligt at få prøver af histologisk kvalitet af dette væv. Melanosomer adskiller sig signifikant i geometri mellem iris og RPL hos både Loligo (F1,90 = 7,275, p = 8,35-3) og Sepia (F1,48 = 10,94, p = 1,79-3) (figur 2a,c) (figur 2a,c). Forskelle i geometrien af øjenmelanosomer hos Octopus og Petromyzon er statistisk signifikante for nogle, men ikke alle, melanosompopulationer (figur 2b,d; elektronisk supplerende materiale, tabel S4). Ud over melanosomer indeholder blæksprutternes nethinde rigeligt med subangulære, uregelmæssigt formede granula (figur 1c). Denne geometri stemmer ikke overens med den for kendte melanosomer hos hvirveldyr og blæksprutter; granulerne kan således repræsentere ommatiner eller andre lysfølsomme pigmenter, men deres identitet er endnu ikke blevet påvist kemisk. Forskellige væv i øjet hos lampretten og aborren farves for eu- og phaeomelanin (figur 1b,c); AHPO-analyse bekræfter tilstedeværelsen af melanin i disse væv og viser en markant variation i eumelaninkoncentrationer mellem øjnene hos de to hvirveldyr (elektronisk supplerende materiale, tabel S2).

Figur 2. Geometri af øjenmelanosomer. (a) Loligo, (b) Octopus, (c) Sepia og (d) Petromyzon.

Sammenfattende viser vores data, at melanosomer i forskellige væv i øjet har signifikant forskellige geometrier i både uddøende blæksprutter og hvirveldyr (elektronisk supplerende materiale, tabel S3 og S4; figur 2).

(b) Kemi af øjenmelanosomer

Vi brugte SRS-XRF og XANES til at teste, om spormetallkemi kan skelne mellem hvirveldyrs og blækspruttes øjenmelanosomer. I øjnene hos blæksprutter og blæksprutter er det kun Cu, der viser en slående rumlig fordeling (figur 3a,b): det er beriget i scleraen, men ikke i den melaninrige RPL (eller andre væv). Zn viser en subtil fordeling i begge de analyserede blækspruttetaxa: det er let beriget i RPL hos blæksprutter og i mindre grad i sclera hos blæksprutter. Hos hvirveldyrene viser de melanosombærende væv imidlertid en markant fordeling af Zn (og hos lampretten Fe og Cu) (figur 3c,d). Hos lampretten er Fe beriget i iris, Zn er beriget i iris og især i choroid og RPE, og Cu er beriget i alle melanosombærende væv. Hos aborre er Zn beriget i alle melanosombærende væv. I XRF-kort over øjne fra nulevende hvirveldyr kan choroid og RPE ikke adskilles ved hjælp af sporstofkemi eller ultrastruktur, hvilket gør det nødvendigt at behandle dem som et enkelt væv. Vi mener ikke, at dette påvirker vores hovedresultater, da vores data fra blæksprutter og andre hvirveldyrs øjenvæv viser, at intraspecifik kemisk variation er lille i forhold til interspecifik variation (figur 4a,b). Melanosom-rige væv i øjnene hos uddøde hvirveldyr, men ikke blæksprutter, er således beriget med Zn (og undertiden Fe og Cu) i forhold til andre okulære væv.

Figur 3. SRS-XRF-analyse af histologiske snit af Loligo (a), Octopus (b), Petromyzon (c) og Dicentrachus (d) og af fossile hvirveldyr (Teleostei) Tetradontiformes indet. (e) og Knightia (f), fossile blæksprutter Keuppia (g) og Tullimonstrum (CKGM F 6426) (h). Histologiske snit er farvet med Warthin-Starry; melanin fremstår sort. SRS-XRF-kort i (a-h) er af områder, der er vist i histologiske snit og fotografier. Se det elektroniske supplerende materiale, figur S2, for placering af regioner på fotografier af histologiske snit og for placering af regioner på fotografier af de viste fossiler. Sorte pile, iris; pilespidser, RPL; asterisk, RPE; hvide pile, sclera. De maksimale koncentrationsværdier for hvert SRS-XRF-kort er angivet i det elektroniske supplerende materiale, tabel S5. (Online-version i farver.)

Figur 4. Sporelementkemi hos eksisterende og fossile blæksprutter og hvirveldyr samt Tullimonstrum. (a) LDA baseret på målte koncentrationer af Ti, Fe, Cu og Zn. (b) Biplot af nøgleelementer, der bidrager til variationen i (a). (c) XANES-spektre af udvalgte eksemplarer og standarder ved Cu K-kanten (stiplet linje ved 8987 eV). Den større variation i kemien mellem Tullimonstrum og andre Mazon Creek-fossiler i (a) i forhold til variationen mellem andre fossile biotas er til stede, selv når Fe fjernes fra datasættet (elektronisk supplerende materiale, figur S4c,d). Pilespidserne i (c) angiver placeringen af præ-kantelementer i disse spektrer. Data for fossile blæksprutteblæksprutter er fra .

For at teste, om dette signal vedvarer i fossiler, analyserede vi øjenpletter i to fossile blæksprutter og fire fossile hvirveldyr. Bortset fra Mazon Creek-blæksprutten Pohlsepia indeholder øjenpletterne i alle eksemplarer melanosomlignende mikroorganer (elektronisk supplerende materiale, figur S3). SRS-XRF-kort viser, at øjenpletterne i de fossile hvirveldyr Knightia og Tetradontiformes indet. (figur 3e-f) er beriget med Ti og Cu i forhold til den sedimentære matrix, med en mindre berigelse af Zn i sidstnævnte. I modsætning hertil er øjenpletten hos Keuppia kun relativt beriget i Ti, Fe og Zn (figur 3g). Øjenpletten af Tullimonstrum er beriget med Ti, Fe, Cu og Zn i forhold til det omgivende blødt væv (figur 3h). Disse kemiske data er ikke helt i overensstemmelse med signalet i de undersøgte fossile blæksprutter eller fossile hvirveldyr.

Vi brugte LDA til at undersøge variationen i koncentrationerne af de vigtigste grundstoffer Ti, Fe, Cu og Zn i vores datasæt. Øjenvæv i uddøde hvirveldyr og blæksprutter plotter i separate regioner af chemospace og separat fra deres fossile modstykker (figur 4a,b). Det er kritisk, at sporstofkemien i øjenpletterne hos ubestemte hvirveldyr fra Mazon Creek er forskellig fra begge eksemplarer af Tullimonstrum, som plotter tæt sammen. Adskillelsen af de entydige hvirveldyr fra Mazon Creek fra Tullimonstrum langs LD2-aksen afspejler førstnævntes berigelse af Zn og, i mindre grad, Cu og Fe: interessant nok afspejler dette variationen i kemien mellem eksisterende hvirveldyr og blæksprutter. Øjenpletterne hos Tullimonstrum er imidlertid kemisk forskellige fra dem hos Pohlsepia, en entydig blæksprutte fra Mazon Creek.

Vi undersøgte variationen i oxidationstilstanden af Cu, et metal, der almindeligvis er forbundet med melanin , i udvalgte fossile og moderne taxa ved hjælp af XANES. XANES-spektre ved Cu K-kanten, der er taget fra lamprettens choroid og fra to fossile hvirveldyrs øjenpletter, viser alle absorptionstoppe centreret ved 8994 ± 1 eV, hvilket indikerer stærke bidrag fra Cu(II) (figur 4c). Spektre fra blækspruttens RPL (melaniseret) og sclera (ikke-melaniseret) ligner stort set dem fra hvirveldyrene, men viser præ-kanttræk ved henholdsvis 8978,59 eV og 8977,58 eV, hvis positioner afslører tilstedeværelsen af Cu(I) . I spektret fra Keuppia er der en pre-edge-funktion, der spænder fra 8976,73-8984,27 eV, hvilket også afspejler et Cu(I)-bidrag. Tilstedeværelsen af Cu(I) i XANES-spektre fra eksisterende og fossile blæksprutteøjne kan afspejle en reduktion af Cu(II) under analysen. Hvirveldyrprøverne viser imidlertid ikke noget bidrag fra Cu(I), selv om de er analyseret under identiske forsøgsbetingelser (spektrer for nogle hvirveldyrprøver (f.eks. Knightia) viser meget svage præ-kanttræk, men disse er mindre let at fortolke som entydige beviser for Cu(I)). Alternativt kan Cu(I)-bidragene i øjenvæv fra blæksprutteøjen stamme fra deoxygeneret hæmocyanin, blækspruttets respiratoriske molekyle . XANES-spektret fra Tullimonstrum viser en dominerende top ved 8994,38 eV og en fremtrædende præ-kantfunktion ved 8987,8-8990,2 eV. Disse træk er i overensstemmelse med bidrag fra flere Cu-oxidationstilstande, herunder et tydeligt Cu(I)-bidrag , som hos de eksisterende og fossile blæksprutter.

Diskussion

Vores undersøgelse afslører, at øjnene hos eksisterende blæksprutter besidder melanosomer med vævsspecifikke geometrier. Sammenfaldet af blæksprutteøjet under henfaldet kunne potentielt generere størrelsesspecifikke lag af melanosomer, der overfladisk ligner dem i hvirveldyrenes RPE (figur 1a,b). Tilstedeværelsen af melanosomer med vævsspecifikke størrelser og/eller geometrier i øjnene af nulevende blæksprutter (figur 2a,c) indikerer derfor, at successive lag af melanosomer af forskellige størrelser og/eller geometrier i fossiler ikke automatisk kan fortolkes som bevis for hvirveldyrs RPE. I hvilket omfang andre fossile grupper af hvirvelløse dyr har bevaret øjenmelanosomer er ukendt (men se Lindgren et al. for kemiske beviser for melanin i øjnene hos fossile insekter).

Melanin i øjnene hos nulevende hvirveldyr kan binde forskellige elementer, hvis relative hyppighed kan variere med biologiske og miljømæssige faktorer . I hvirveldyr kan melanin binde metalioner og potentielt forhindre oxidative vævsskader . Sammenlignet med hvirveldyr viser blæksprutteøjne lave koncentrationer af metaller i melaniseret væv (figur 3a,b). Dette afspejler sandsynligvis den relativt lave forekomst af melanin (elektronisk supplerende materiale, tabel S2) og antyder, at andre veje end melanin er ansvarlige for at forhindre vævsskader som følge af eksponering for metalioner hos blæksprutter, dvs. at melaninets funktion i blæksprutternes øjne adskiller sig fra hvirveldyrenes. Variationen i melaninindholdet i uddøde hvirveldyrs øjne (elektronisk supplerende materiale, tabel S2) kan potentielt afspejle variationer i økologi og/eller lyshabitat.

Vores kemiske data om uddøde hvirveldyr og blæksprutter viser, at variationen mellem klasser er markant større end variationen inden for en af grupperne (figur 3a-d). De melaniserede væv i øjnene hos uddøde hvirveldyr er beriget med Zn (figur 4a,b) og viser et stærkt Cu(II)-signal i XANES-spektrer (figur 4c); i modsætning hertil er melaniserede væv i uddøde blæksprutter lavt indhold af Zn og viser et blandet bidrag fra Cu(I) og Cu(II). Tilsvarende er øjenmelanosomer i Tullimonstrum lavt indhold af Zn i forhold til dem i hvirveldyr fra Mazon Creek, og XANES-spektre viser tilstedeværelsen af Cu(I). Øjenpletterne hos Pohlsepia er imidlertid ikke sammenfaldende med Tullimonstrum eller med Mazon Creek-hvirveldyrene i LDA chemospace. Kemien hos de entydige hvirveldyr og blæksprutter i Mazon Creek passer således ikke til det generelle mønster af elementberigelse hos moderne blæksprutter og hvirveldyr. Samlet set er dataene om melanosom-morfologi og -kemi ikke fuldt ud i overensstemmelse med en affinitet mellem hvirveldyr og Tullimonstrum. En affinitet med hvirvelløse dyr kan ikke udelukkes, men en affinitet med blæksprutter er usandsynlig i betragtning af fraværet af andre diagnostiske morfologiske karakterer.

Den kemiske struktur af melanin er kendt for at blive ændret ved ændringer i pH og eksponering for forhøjede metalkoncentrationer , tryk og temperaturer , som alle er almindeligt forekommende under diagenese. Det er derfor sandsynligt, at melanosomer i forskellige fossile taxa fra samme eller forskellige biotas kan følge forskellige diagenetiske veje og dermed resultere i uensartede sporstofkemier (som det fremgår af undersøgelser af den organiske geokemi af fossile melaniner ). Den kemiske variation mellem fossiler, der er observeret heri (figur 3e-h), afspejler formodentlig variation i værtslitologi og/eller diagenetisk historie. For eksempel tyder fraværet af bevarede melanosomer i Pohlsepia på, at dette eksemplar oplevede en mere omfattende ændring under diagenese end de andre fossile eksemplarer, der blev analyseret. Endvidere er variationen i sporelementkemien blandt Mazon Creek-fossiler større end for fossiler fra alle andre biotoper. Dette tyder på, at den kemiske diagenese af melanosomer i Mazon Creek-fossiler er mere variabel end for andre biotas, hvilket udelukker en entydig fortolkning af den oprindelige sporstofkemi. Ikke desto mindre har øjnene af Knightia og eksemplaret af Tetradontiformes indet. lignende spormetalsignaturer på trods af, at de stammer fra forskellige biotas og dermed formodentlig har forskellige diagenetiske historier. Fremtidige undersøgelser, der er rettet mod reaktionen af melanosomernes sporstofkemi på forskellige diagenetiske faktorer, f.eks. pH, lithologi, tryk og temperatur, vil være afgørende for at skelne den oprindelige kemi fra kemiske produkter af diagenese.

Datatilgængelighed

Vi stiller alle data til rådighed i hovedteksten, elektronisk supplerende materiale eller via Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601 .

Autors bidrag

C.S.R. og T.I.A. udførte histologi; C.S.R., T.I.A. og M.E.M. udførte SEM; C.S.R., M.E.M. og S.M.W. udførte synkrotron hurtig scanning-X-ray fluorescens og X-ray absorptionsspektroskopi (XAS); S.I. og K.W. udførte AHPO-analyser; C.S.R. og M.E.M. skrev manuskriptet med input fra alle andre forfattere.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Funding

Støttet af European Research Starting Grant (grant no. ERC-2014-StG-637691-ANICOLEVO) tildelt M.E.M. Brugen af Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, er støttet af US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences under kontrakt no. DE-AC02-76SF00515.

Anerkendelser

Vi takker A. Aase, S. Gabbott, Z. Hughes, R. Gaines, B. Lindow, P. Mayer, D. Mikulic, W. Simpson og A. Stroup for adgang til prøverne; N. Edwards for XAS-understøttelse; V. Rossi og R. Wogelius for diskussion.

Fodnoter

Elektronisk supplerende materiale er tilgængeligt online på https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4691789.

© 2019 The Author(s)

Published by the Royal Society. All rights reserved.

  • Oakley TH, Speiser DI. 2015Hvordan kompleksitet opstår: evolutionen af dyrs øjne. Annu. Rev. Ecol. Evol. syst. 46, 237-260. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135907) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Clements T, Dolocan A, Martin P, Purnell MA, Vinther J, Gabbott SE. 2016The eyes of Tullimonstrum gregarium (Mazon Creek, Carboniferous) afslører en affinitet med hvirveldyr. Nature 532, 500-503. (doi:10.1038/nature17647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Liu Y, Hong L, Wakamatsu K, Ito S, Adhyaru BB, Cheng C-Y, Bowers CR, Simon JD. 2005Forhold mellem de strukturelle og kemiske egenskaber af melanosomer isoleret fra retinalt pigmentepithel, iris og choroid fra nyfødte og modne bovine øjne. Photochem. Photobiol. 81, 510-516. (doi:10.1562/2004-10-19-RA-345.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Durairaj C, Chastain JE, Kompella UB. 2012Intraokulær fordeling af melanin i menneske-, abe-, kanin-, minipig- og hundeøjne. Exp. Eye Res. 98, 23-27. (doi:10.1016/j.exer.2012.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Zhang QX, Lu RW, Messinger JD, Curcio CA, Guarcello V, Yao XC. 2013In vivo optisk kohærens tomografi af lysdrevet melanosomtranslokation i retinalt pigmentepithel. Sci. Rep. 3, 2644. (doi:10.1038/srep02644) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Fernald RD. 2000Evolution af øjne. Curr. Opin Neurobiol. 10, 454-450. (doi:10.1016/S0959-4388(00)00114-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Palumbo A. 2003Melanogenese i blækkirtlen hos Sepia officinalis. Pigment Cell Res. 16, 517-522. (doi:10.1034/j.1600-0749.2003.00080.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Schraermeyer U. 1994Fine structure of melanogenesis in the ink sac of Sepia officianalis. Pigment Cell Melanoma Res. 7, 52-60. (doi:10.1111/j.1600-0749.1994.tb00018.x) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Ito S, Miyake S, Maruyama S, Suzuki I, Commo S, Nakanishi Y, Wakamatsu K. 2018Acid hydrolysis reveals a low but constant level of pheomelanin in human to black to brown hair. Pigment Cell Melanoma Res. 31, 393-403. (doi:10.1111/pcmr.12673) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Wakamatsu K, Ito S, Rees JL. 2002Nytteværdien af 4-amino-3-hydroxyphenylalanin som en specifik markør for pheomelanin. Pigment Cell Res. 15, 225-232. (doi:10.1034/j.1600-0749.2002.02009.x) Crossref, PubMed, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2007Current understanding of the binding site, capacity, affinity, and biological significance of metals in melanin. J. Phys. Chem. B 111, 7938-7947. (doi:10.1021/jp071439h) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Rossi V, McNamara ME, Webb S, Ito S, Wakamatsu K. 2019Tissuespecifik geometri og kemi af moderne og fossiliserede melanosomer afslører intern anatomi af uddøde hvirveldyr. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 17 880-17 889. (doi:10.1073/pnas.1820285116) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Joly-Tonetti N, Wibawa JID, Bell M, Tobin D. 2016Melanin fate in the human epidermis: a reassessment of how best to detect and analysis histologically. Exp. Dermatol. 25, 501-504. (doi:10.1111/exd.13016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. 2001PAST: palæontologisk statistiksoftwarepakke til uddannelse og dataanalyse. Palaeontol. Electron. 4, 9. Google Scholar
  • Webb SM. 2011Den mikroanalytiske værktøjskasse: Røntgenfluorescens-billedbehandlingssoftware. AIP Conf. Proc. 1365, 196-199. (doi:10.1063/1.3625338) Crossref, Google Scholar
  • Wogelius RAet al..2011Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science 333, 1622-1626. (doi:10.1126/science.1205748) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Ravel B, Newville M. 2005Athena, Artemis, Hephaestus: dataanalyse for røntgenabsorptionsspektroskopi ved hjælp af IFEFFIT. J. Synchrotron Radiat. 12, 537-541. (doi:10.1107/S090909049505012719) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Schraermeyer U, Stieve H, Rack M. 1995Immunoelektronmikroskopisk undersøgelse af G-proteinfordelingen på fotoreceptorcellerne hos blæksprutten Sepia officinalis. Tissue Cell 27, 317-322. (doi:10.1016/S0040-8166(95)80052-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Kau LS, Spira-Solomon DJ, Penner-Hahn JE, Hodgson KO, Solomon EI. 1987X-ray absorption edge determination of the oxidation state and coordination number of copper: application to the type 3 site in Rhus vernicifera Laccase and its reaction with oxygen. J. Am. Chem. Soc. 21, 6433-6442. Crossref, ISI, Google Scholar
  • Coates CJ, Nairn J. 2014Diverse immune funktioner af hæmocyaniner. Dev. Comp. Immunol. 45, 43-55. (doi:10.1016/j.dci.2014.01.021) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Lindgren Jet al.. 2019Fossile insektøjne kaster lys over trilobitoptik og gleddyrs pigmentskærm. Nature 573, 122-125. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Hong L, Simon JD. 2005Fysisk og kemisk karakterisering af iris- og choroidmelanosomer isoleret fra nyfødte og modne køer. Photochem. Photobiol. 81, 517-523. (doi:10.1562/2005-03-02-RA-453.1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Sallan L, Giles S, Sansom RS, Clarke JT, Johanson Z, Sansom IJ, Janvier P. 2017The ‘Tully Monster’ is not a vertebrate: characters, convergence and taphonomy in Palaeozoic problematic animals. Palaeontology 60, 149-157. (doi:10.1111/pala.12282) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Foster M. 1979A reappraisal of Tullimonstrum gregarium. In Mazon creek fossils (ed. Nitecki MH), pp. 269-301. New York, NY: Academic Press. Crossref, Google Scholar
  • Beall B. 1991The Tully Monster and a new approach to analysing problematica. In The early evolution of Metazoa and the significance of problematic taxa: international symposium (eds Conway-Morris S, Simonetta AM), pp. 271-286. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Google Scholar
  • Smith MR, Caron J-B. 2010Primitive blødkødede blæksprutter fra det kambriske område. Nature 465, 469-472. (doi:10.1038/nature09068) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009Adsorption af Pb(II) og Cd(II) af blæksprutte Ommastrephes bartrami melanin. Bioinorg. Chem. Appl. 2009, 901563. (doi:10.1155/2009/901563) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar
  • Colleary Cet al.2015Chemical, experimental and morphological evidence for diagenetically altered melanin in exceptionally preserved fossils. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 12 592-12 597. (doi:10.1073/pnas.1509831112) Crossref, ISI, Google Scholar
  • Rogers CS, Astrop TI, Webb SM, Ito S, Wakamatsu K, McNamara ME. 2019 Data fra: Synkrotron X-ray absorptionsspektroskopi af melanosomer i hvirveldyr og cephalopoder: implikationer for affiniteten af Tullimonstrum. Dryad Digital Repository. (https://doi.org/10.5061/dryad.c5c7601) Google Scholar